מחשבון חיבור DNA - חישוב יחסי הוספה:וקטור לשיבוט מולקולרי

ליגציית DNA היא השלב בשיבוט מולקולרי שבו מקטע אינסרט מחובר לווקטור פלסמידי באמצעות האנזים T4 DNA ליגאז. מחשבון ליגציית DNA מחשב כמה מיקרוליטרים של DNA אינסרט ושל DNA וקטור יש לערבב כדי שהתגובה תגיע ליחס מולרי נבחר בין האינסרט לווקטור.

מה עושה המחשבון

המחשבון מקבל שישה נתונים: ריכוז הווקטור, אורך הווקטור, ריכוז האינסרט, אורך האינסרט, היחס המולרי היעד בין האינסרט לווקטור ונפח התגובה הכולל. הוא גם מאפשר למשתמש להגדיר כמה DNA וקטורי להשתמש, כאשר ברירת המחדל היא 50 ננוגרם (ng). מתוך ערכים אלה הוא מחשב את נפח הווקטור שיש לפפט, את נפח האינסרט שיש לפפט, ואת נפח תמיסת החיץ או המים שיש להוסיף כדי להגיע לנפח התגובה הכולל.

הריכוז נמדד בננוגרם למיקרוליטר (ng/μL), ובדרך כלל נקרא במכשיר Nanodrop או Qubit. האורך נמדד בזוגות בסיסים (bp). קילובסיס אחד (kb) שווה ל־1000 זוגות בסיסים. היחס המולרי מתאר כמה מולקולות אינסרט צריכות להיות נוכחות עבור כל מולקולת וקטור אחת. זה אינו יחס של מסה.

מדוע משתמשים ביחס מולרי ולא במסה

מסות שוות של DNA אינן מכילות מספרים שווים של מולקולות. אינסרט קצר שוקל פחות מווקטור ארוך כאשר מספר המולקולות שלהם זהה. ערבוב כמויות שוות בננוגרמים של אינסרט קצר ושל וקטור ארוך יותיר מעט מדי מולקולות אינסרט ביחס למולקולות הווקטור. המחשבון מתאים את מסת האינסרט לפי היחס בין אורכי המקטעים, כך שבתערובת הסופית יהיה מספר המולקולות הרצוי של אינסרט לכל מולקולת וקטור.

נוסחת ליגציית DNA

כמות ה-DNA של האינסרט הדרושה, בננוגרמים, היא:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

כאשר $m_i$ היא כמות האינסרט בננוגרמים, $m_v$ היא כמות הווקטור בננוגרמים, $k_i$ הוא אורך האינסרט בקילובסיסים, $k_v$ הוא אורך הווקטור בקילובסיסים, ו-R הוא היחס המולרי היעד בין האינסרט לווקטור.

לאחר שכמות זו ידועה, המחשבון ממיר כל כמות לנפח שניתן לפיפט:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

כאשר $V_v$ ו־$V_i$ הם נפחי הווקטור והאינסרט במיקרוליטרים, $c_v$ ו־$c_i$ הם ריכוזי הווקטור והאינסרט בננוגרם למיקרוליטר, $V_b$ הוא נפח הבאפר, ו־$V_t$ הוא נפח התגובה הכולל.

אם נפחי הווקטור והאינסרט יחד גדולים מנפח התגובה הכולל, לא נותר מקום לתמיסת חיץ, לליגאז או למים. במקרה כזה המחשבון מדווח שהנפח הכולל קטן מדי, במקום להציג כמות שלילית של תמיסת חיץ.

דוגמה פתורה

חוקר משבט מקטע גן באורך 1 kb לתוך וקטור פלסמידי באורך 3 kb. התוכנית היא להשתמש ב־50 ng של DNA וקטור ביחס מולרי אינסרט:וקטור של 3:1, בתגובה בנפח 20 μL.

נתוני קלט:

• ריכוז הווקטור: 50 ng/μL
• אורך הווקטור: 3000 bp (3 kb)
• ריכוז האינסרט: 25 ng/μL
• אורך האינסרט: 1000 bp (1 kb)
• יחס מולרי: 3
• נפח כולל: 20 μL
• כמות הווקטור: 50 ng

שלב 1: כמות האינסרט

ננוגרמים של אינסרט = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

שלב 2: נפחים

נפח הווקטור = 50 ng ÷ 50 ng/μL = 1 μL

נפח האינסרט = 50 ng ÷ 25 ng/μL = 2 μL

נפח הבאפר = 20 − 1 − 2 = 17 μL

התגובה מורכבת מ־1 μL של וקטור, 2 μL של אינסרט ו־17 μL של תמיסת חיץ או מים, שאליהם מוסיפים גם את הליגאז ואת תמיסת החיץ לתגובה שלו. תערובת זו מספקת שלוש מולקולות אינסרט לכל מולקולת וקטור.

יחסים מולריים אופייניים לליגציה

ברוב פעולות השיבוט הסטנדרטיות עם קצוות דביקים, כלומר קצוות חד־גדיליים בולטים, משתמשים ביחס אינסרט:וקטור של 3:1. ליגציות המחברות קצוות קהים יעילות פחות, ולכן יחס גבוה יותר, כגון 5:1, נפוץ. לעיתים מקטעים גדולים מאוד פועלים טוב יותר ביחס נמוך יותר, הקרוב ל־1:1, משום שמקטעים גדולים כבר תורמים זוגות בסיסים רבים לכל מולקולה.

שאלות נפוצות

מהי ליגציית DNA?

ליגציית DNA היא חיבור של שני מקטעי DNA, בדרך כלל וקטור פלסמידי ואינסרט, למולקולה רציפה אחת. האנזים T4 DNA ליגאז אוטם את החיבור בין קצות המקטעים.

מה משמעות היחס המולרי אינסרט:וקטור?

זהו מספר מולקולות ה-DNA של האינסרט הנוכחות עבור כל מולקולת וקטור אחת בתגובה. יחס של 3:1 פירושו שלוש מולקולות אינסרט לכל מולקולת וקטור, ללא קשר להשוואה בין המסות שלהן.

מדוע לא להשתמש בכמויות שוות בננוגרמים של וקטור ואינסרט?

למקטעי DNA באורכים שונים יש מסות שונות לכל מולקולה. אינסרט באורך 1 kb שוקל בערך שליש מווקטור באורך 3 kb, מולקולה מול מולקולה. כמויות שוות בננוגרמים מכל אחד לא יספקו מספרים שווים של מולקולות, ולכן המחשבון מתאים את מסת האינסרט כדי להתאים ליחס המולרי היעד.

מה המשמעות של נפח כולל קטן מדי?

פירוש הדבר שנפחי הווקטור והאינסרט לבדם כבר מנצלים את כל נפח התגובה, ולא נותר מקום לתמיסת חיץ או לליגאז. הפתרון הוא להגדיל את נפח התגובה הכולל או להשתמש בתמיסות DNA מרוכזות יותר.

האם אפשר להשתמש במחשבון הזה להרכבת Gibson או לשיבוט Golden Gate?

לא. שיטות אלה משתמשות בכימיה שונה של תגובה ובדרך כלל מכוונות לכמויות אקווימולריות של כל המקטעים, ולא ליחס אינסרט:וקטור קבוע. חישובי הנפחים שלהן שונים מאלה של שיבוט סטנדרטי באמצעות T4 ליגאז.

כמה DNA וקטור משתמשים בדרך כלל?

50 ng היא כמות התחלתית נפוצה לתגובת ליגציה סטנדרטית. במעבדות משתמשים גם בכמויות שבין 25 ל־100 ng, בהתאמה לריכוז ה-DNA ולהיקף התגובה.