מחשבון ריכוז DNA | ממיר A260 ל-ng/μL

מחשבון ריכוז DNA

מחשבון ריכוז DNA ממיר קריאת בליעת UV באורך גל של 260 ננומטר, הנקראת A260, לריכוז DNA בננוגרמים למיקרוליטר (ng/µL). הוא גם מציג את הכמות הכוללת של DNA בדגימה, במיקרוגרמים (µg).

מהי בליעת A260?

A260 היא כמות האור האולטרה־סגול שתמיסה בולעת באורך גל של 260 ננומטר. DNA בולע אור UV בעוצמה הרבה ביותר בקרבת אורך גל זה, בגלל הבסיסים הנוקלאוטידיים שלו. ספקטרופוטומטר מודד את A260 לאחר שמדידת בלנק, המשתמשת באותו בופר כמו הדגימה, מסירה את בליעת הרקע. ככל שיש יותר DNA בתמיסה, קריאת A260 גבוהה יותר.

נוסחת ריכוז DNA

DNA דו־גדילי בולע אור UV ביחס לריכוז שלו, קשר הידוע כחוק ביר–למברט. במסלול אור סטנדרטי באורך 1 סנטימטר, תמיסה עם קריאת A260 של 1.0 מכילה בערך 50 ng למיקרוליטר DNA דו־גדילי. מספר זה, גורם ההמרה, ממיר כל קריאת A260 לריכוז:

ריכוז DNA (ng/µL) = A260 × 50 × מקדם הדילול

מקדם הדילול מביא בחשבון כל דילול שבוצע לפני מדידת הדגימה. לדגימה שנמדדה ללא דילול יש מקדם דילול של 1.

כיצד לחשב את תפוקת ה-DNA הכוללת

לאחר שנקבע הריכוז, אפשר לחשב את המסה הכוללת של ה-DNA בדגימה לפי הנפח שלה:

סה״כ DNA (µg) = ריכוז (ng/µL) × נפח (µL) ÷ 1000

כיצד לחשב את ריכוז ה-DNA: שלב אחר שלב

1. ערבבו היטב את הדגימה לפני המדידה. DNA עלול להיצמד לדפנות המבחנה או לשקוע באופן לא אחיד.
2. דללו את הדגימה אם הריכוז שלה גבוה, ושאפו לקריאת A260 שבין 0.1 ל־1.0. קריאות הספקטרופוטומטר פחות מהימנות מחוץ לטווח זה.
3. בצעו מדידת בלנק בספקטרופוטומטר באמצעות אותו בופר ששימש לדילול, ולאחר מכן מדדו את הדגימה ב־260 ננומטר.
4. הזינו למחשבון את קריאת A260, את נפח הדגימה ואת מקדם הדילול כדי לקבל את הריכוז ואת התפוקה הכוללת. יש למלא את כל שלושת השדות, והנפח חייב להיות גדול מאפס, לפני שתוצאה תופיע.

דוגמה פתורה

דוגמה 1: דגימה שלא דוללה

קריאת A260 של 0.5, ללא דילול (מקדם דילול 1), ונפח דגימה של 100 µL.

• ריכוז = 0.5 × 50 × 1 = 25 ng למיקרוליטר
• סה״כ DNA = 25 × 100 ÷ 1000 = 2.5 µg

דוגמה 2: דגימה מדוללת

במבחנה יש 50 µL של DNA מטוהר. חלק קטן ממנו דולל פי 10, והחלק המדולל נתן קריאת A260 של 0.75. מקדם הדילול ממיר את הקריאה חזרה לריכוז שבמבחנה המקורית, ו־50 µL הוא הנפח שיש להזין בשלב חישוב התפוקה הכוללת.

• ריכוז = 0.75 × 50 × 10 = 375 ng למיקרוליטר
• סה״כ DNA = 375 × 50 ÷ 1000 = 18.75 µg

חישוב מקדם הדילול

מקדם דילול = הנפח הכולל לאחר הדילול ÷ נפח הדגימה המקורית.

הוספת 5 µL של תמיסת DNA ל־45 µL של בופר נותנת נפח כולל של 50 µL, ולכן מקדם הדילול הוא 50 ÷ 5 = 10. לדגימה שלא דוללה יש מקדם דילול של 1.

טווחי ריכוז אופייניים של DNA

הריכוז תלוי בסוג הדגימה ובשיטת המיצוי. מיצויי DNA גנומי נמצאים בדרך כלל בין כ־10 ל־100 ng למיקרוליטר. הכנת DNA פלסמידי מניבה לעיתים קרובות ריכוזים גבוהים יותר, לעיתים כמה מאות ng למיקרוליטר. תוצאה החורגת במידה רבה מהטווח הצפוי לשיטה מסוימת עשויה להצביע על בעיה במיצוי או במדידה עצמה.

מגבלות מדידת בליעת UV

מדידת A260 מהירה, אך אינה השיטה הרגישה או הספציפית ביותר ל-DNA. חלבונים, RNA ורכיבי בופר מסוימים בולעים אף הם אור בקרבת 260 ננומטר ועלולים להגדיל את הקריאה. מדענים בודקים לעיתים קרובות את היחס A260/A280 לצד הריכוז כדי לסנן זיהום בחלבונים; יחס הקרוב ל־1.8 מצביע בדרך כלל על דגימת DNA טהורה. שיטות המבוססות על צבעים פלואורסצנטיים, כגון בדיקות Qubit, נקשרות רק ל-DNA דו־גדילי ומספקות קריאה מדויקת יותר בדגימות מדוללות או לא טהורות, אף שהן דורשות ריאגנטים נוספים ופלואורומטר.

שאלות נפוצות

כיצד מחשבים ריכוז DNA מ־A260?

הכפילו את קריאת A260 ב־50, גורם ההמרה הסטנדרטי ל-DNA דו־גדילי, ולאחר מכן הכפילו במקדם הדילול. אם הדגימה לא דוללה, השתמשו במקדם דילול של 1.

מהו יחס A260/A280 טוב?

יחס הקרוב ל־1.8 מצביע בדרך כלל על דגימת DNA טהורה. יחס נמוך יותר מצביע על זיהום בחלבונים. יחס הגבוה מ־2.0 עשוי להצביע על זיהום ב־RNA.

האם אפשר להשתמש במחשבון זה עבור RNA?

לא ישירות, מכיוון שעבור RNA משתמשים בגורם המרה של 40 ng למיקרוליטר במקום 50. כדי להעריך את ריכוז ה-RNA, הכפילו את תוצאת המחשבון ב־0.8 (40 ÷ 50), או השתמשו ישירות ב־A260 × 40 × מקדם הדילול.

מדוע קריאת A260 צריכה להיות בין 0.1 ל־1.0?

הבליעה נשארת בקירוב ביחס ישר לריכוז, כפי שמתואר בחוק ביר–למברט, בעיקר בתוך טווח זה. מחוץ לטווח הקריאות נעשות פחות מהימנות, ולכן יש לדלל או לרכז דגימה מרוכזת מדי או מדוללת מדי לפני מדידה חוזרת.

מה ההבדל בין ריכוז לטוהר?

ריכוז מודד כמה DNA קיים, ב־ng למיקרוליטר. טוהר מודד עד כמה הדגימה נקייה, בעיקר לפי יחסי בליעה כגון A260/A280. דגימה יכולה להיות בעלת ריכוז גבוה ועדיין להיות לא טהורה, או בעלת ריכוז נמוך וטהורה מאוד.

כיצד ממירים ng למיקרוליטר ל־µg למיליליטר?

לשתי היחידות אותו ערך מספרי. 1 ng למיקרוליטר שווה ל־1 µg למיליליטר, מכיוון שגם יחידת המסה וגם יחידת הנפח משתנות לפי גורם של 1000.

מקורות

1. Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). שיבוט מולקולרי: מדריך מעבדה (מהדורה 3). הוצאת מעבדת קולד ספרינג הרבור.
2. Gallagher, S. R., & Desjardins, P. R. (2006). כימות DNA ו-RNA באמצעות ספקטרוסקופיית בליעה ופלואורסצנציה. פרוטוקולים עדכניים בביולוגיה מולקולרית, 76(1), A-3D.
3. Manchester, K. L. (1995). ערכם של יחסי A260/A280 למדידת טוהר חומצות גרעין. BioTechniques, 19(2), 208–210.