מחשבון טמפרטורת היברידציה של DNA | כלי Tm חינמי לPCR

מהו מחשבון לטמפרטורת היברידיזציה של DNA?

מחשבון לטמפרטורת היברידיזציה של DNA מעריך את טמפרטורת ההתכה (Tm) של פריימר DNA לפי הרצף שלו. Tm היא הטמפרטורה שבה מחצית ממולקולות הפריימר קשורות לגדיל המטרה שלהן ומחציתן אינן קשורות אליו. בתגובת שרשרת של פולימראז (PCR), ערך זה מנחה את בחירת הטמפרטורה שבה הפריימרים נקשרים לתבנית ה-DNA.

מדוע טמפרטורת ההיברידיזציה חשובה ב-PCR

PCR משכפל מקטע מטרה של DNA באמצעות מחזורי חימום וקירור חוזרים. כל מחזור כולל שלושה שלבים. ראשית, חימום מפריד את התבנית הדו-גדילית בטמפרטורה של בערך 95 °C. שלב זה נקרא דנטורציה. שנית, התגובה מתקררת לטמפרטורת ההיברידיזציה, בדרך כלל בין 50 °C ל-65 °C, כדי שפריימרים קצרים יוכלו להיקשר לרצפים תואמים בגדילים החד-גדיליים. שלישית, הטמפרטורה עולה לכ-72 °C, ואנזים הנקרא DNA פולימראז מאריך את הפריימרים ובונה גדילי DNA חדשים.

אם טמפרטורת ההיברידיזציה נמוכה מדי, הפריימרים נקשרים לרצפים התואמים להם רק חלקית, ונוצרים מקטעי DNA נוספים ולא רצויים. אם היא גבוהה מדי, הפריימרים אינם יכולים ליצור קשר יציב עם התבנית, ומעט DNA או כלל לא משוכפל. טמפרטורת ההיברידיזציה היא אחת ההגדרות הראשונות שחוקרים משנים כאשר תגובת PCR נכשלת.

כיצד תכולת GC משפיעה על Tm

פריימר נקשר למטרה שלו באמצעות קשרי מימן. זוג גואנין-ציטוזין (G-C) יוצר שלושה קשרי מימן. זוג אדנין-תימין (A-T) יוצר שניים. פריימר המכיל יותר בסיסי G ו-C דורש יותר חום כדי להיפרד, ולכן ה-Tm שלו גבוה יותר מזה של פריימר באותו אורך המכיל יותר בסיסי A ו-T. תכולת GC נכתבת בדרך כלל באחוזים: מספר בסיסי G ו-C חלקי האורך הכולל של הרצף, כפול 100.

נוסחה לטמפרטורת ההיברידיזציה של DNA

מחשבון זה משתמש באחת משתי נוסחאות, בהתאם לאורך הפריימר.

עבור פריימרים באורך 14 נוקלאוטידים או יותר, הוא משתמש בנוסחת תכולת ה-GC של מרמור-דוטי:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

כאן N_GC הוא מספר בסיסי ה-G ו-C בפריימר, הנספר ישירות ולא כאחוז. N הוא המספר הכולל של הבסיסים.

עבור פריימרים הקצרים מ-14 נוקלאוטידים, הוא משתמש בכלל וולאס:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A, T, G ו-C מייצגים כל אחד את מספר ההופעות של אותו בסיס בפריימר.

שתי הנוסחאות מניחות תנאי PCR מקובלים: ריכוז פריימר של כ-50 ננומולר וריכוז Na+ של 50 מילימולר.

דוגמה פתורה

נבחן את הפריימר באורך 19 בסיסים ATGCTAGCTAGCTGCTAGC. אורכו הוא 19, כלומר 14 או יותר, ולכן המחשבון משתמש בנוסחת מרמור-דוטי.

• אורך (N) = 19
• מספר ה-G = 5, מספר ה-C = 5, ולכן N_GC = 10, ותכולת ה-GC היא 10 / 19 × 100 ≈ 52.6%
• Tm = 64.9 + 41 × (10 − 16.4) / 19 = 64.9 + 41 × (−6.4) / 19 = 64.9 − 13.8 ≈ 51.1 °C

הנוסחה משתמשת במספר בסיסי ה-GC, 10, ולא באחוז ה-GC, 52.6. שימוש בטעות באחוז נותן Tm הקרוב ל-143 °C, ערך שאינו מציאותי עבור תגובת PCR המתבצעת בין 50 °C ל-95 °C.

כיצד להשתמש במחשבון

הקלידו או הדביקו רצף פריימר המשתמש רק באותיות A, T, G ו-C. המחשבון מציג את אורך הרצף בנוקלאוטידים (nt), את תכולת ה-GC באחוזים ואת טמפרטורת ההיברידיזציה המחושבת במעלות צלזיוס. ניתן להעתיק את התוצאה לרשומות מעבדה או לפרוטוקול.

בחירת טמפרטורת היברידיזציה ל-PCR

Tm הוא אומדן מחושב, ולא טמפרטורת עבודה מובטחת. פרוטוקולי PCR רבים מתחילים את שלב ההיברידיזציה בפועל כמה מעלות מתחת ל-Tm המחושב, ואז מתאימים את הטמפרטורה לפי התוצאה בג׳ל. עבור זוג פריימרים, בדרך כלל משתמשים בערך ה-Tm הנמוך מבין שני הפריימרים כנקודת התחלה. PCR במפל טמפרטורות, שבו מריצים כמה תגובות בו-זמנית בטווח טמפרטורות, הוא דרך מקובלת למצוא את הטמפרטורה הטובה ביותר באמצעות בדיקה.

דרכים אחרות להערכת Tm

נוסחאות מרמור-דוטי ו-וולאס המשמשות כאן הן קירובים מהירים המבוססים רק על הרכב הבסיסים. קיימות שיטות אחרות:

• תרמודינמיקה של השכן הקרוב מביאה בחשבון כיצד כל זוג בסיסים סמוכים משפיע על היציבות, ונחשבת לשיטה המדויקת יותר עבור פריימרים תקניים.
• נוסחאות המתוקנות לפי ריכוז מלח מוסיפות תיקון עבור ריכוז יוני Na+ או K+ בבופר התגובה, מכיוון שריכוז מלח גבוה יותר מייצב את הדו-גדיל של ה-DNA ומעלה את Tm.

מחשבונים שונים עשויים לדווח על ערכי Tm שונים עבור אותו פריימר, משום שהם משתמשים בנוסחאות שונות. הרצת ה-PCR ובדיקת התוצאה נותרות הבדיקה הסופית.

שאלות נפוצות

מהי טמפרטורת ההיברידיזציה של DNA?

זוהי הטמפרטורה שבה פריימרים של DNA נקשרים לרצף התואם להם בגדיל תבנית במהלך PCR. במעבדות בדרך כלל קובעים אותה כמה מעלות מתחת לטמפרטורת ההתכה (Tm) המחושבת של הפריימר.

כיצד מחשבים את Tm של פריימר?

עבור פריימרים באורך 14 בסיסים או יותר, Tm = 64.9 + 41 × (מספר בסיסי GC − 16.4) / אורך. עבור פריימרים הקצרים מ-14 בסיסים, Tm = 2 × (מספר בסיסי A+T) + 4 × (מספר בסיסי G+C).

מדוע תכולת GC מעלה את Tm?

זוגות בסיסים G-C יוצרים שלושה קשרי מימן, לעומת שניים בזוגות A-T. פריימר בעל שיעור גבוה יותר של בסיסי G ו-C דורש יותר אנרגיה, ולכן טמפרטורה גבוהה יותר, כדי להיפרד מהמטרה שלו.

האם טמפרטורת ההיברידיזציה של ה-PCR צריכה להיות שווה ל-Tm המחושב?

לא. רוב הפרוטוקולים מתחילים כמה מעלות מתחת ל-Tm המחושב ומתאימים משם, משום ש-Tm מציין את הנקודה שבה רק מחצית מהפריימר קשורה.

האם אורך הפריימר משנה את ה-Tm?

כן, אם כי לא באופן פשוט. האורך נמצא במכנה של נוסחת מרמור-דוטי, ולכן לפריימר ארוך יותר בעל תכולת GC ממוצעת לא יהיה בהכרח Tm גבוה יותר מזה של פריימר קצר יותר ועשיר ב-GC.

מדוע מחשבוני Tm שונים אינם מסכימים זה עם זה?

הם משתמשים בנוסחאות שונות. כלל וולאס, נוסחת תכולת ה-GC של מרמור-דוטי, תרמודינמיקה של השכן הקרוב ונוסחאות המתוקנות לפי ריכוז מלח עשויים לתת כל אחד ערך Tm שונה עבור אותו פריימר, לעיתים בהפרש של כמה מעלות.

מקורות

1. Marmur J, Doty P. קביעת הרכב הבסיסים של חומצה דאוקסיריבונוקלאית לפי טמפרטורת הדנטורציה התרמית שלה. J Mol Biol. 1962;5(1):109-118.
2. Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. הכלאה של אוליגודאוקסיריבונוקלאוטידים סינתטיים ל-DNA מסוג phi chi 174. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557.
3. SantaLucia J Jr. מבט מאוחד על תרמודינמיקה של השכן הקרוב ב-DNA פולימרי, דמוי-משקולת ואוליגונוקלאוטידי. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465.