מחשבון יעילות qPCR: כלי לניתוח עקומה סטנדרטית

מחשבון יעילות qPCR

מחשבון יעילות qPCR מעריך עד כמה תגובת PCR כמותית (qPCR) מעתיקה את רצף ה-DNA המטרה בכל מחזור הגברה. הוא משתמש בערכי Ct (מספר המחזור שבו האות הפלואורסצנטי חוצה סף שנקבע) מסדרת מיהולים כדי לחשב יעילות, שיפוע, נקודת חיתוך ו-R².

מהי יעילות qPCR?

PCR כמותי עוקב אחר הפלואורסצנציה בזמן שהתגובה מעתיקה רצף DNA מטרה, מחזור אחר מחזור. יעילות ההגברה מתארת בכמה גדלה כמות ה-DNA המטרה בכל מחזור. ביעילות של 100%, כמות ה-DNA המטרה מוכפלת בכל מחזור.

תגובות אמיתיות מגיעות לעיתים רחוקות בדיוק ל-100%. רוב המעבדות מחשיבות יעילות שבין 90% ל-110% כקבילה לכימות מהימן. ערך הנמוך מ-90% או הגבוה מ-110% מצביע על בעיה, כגון תכנון פריימרים לקוי, מעכבי PCR שנותרו ממיצוי הדגימה, או שגיאות פיפטור בסדרת המיהולים.

ליעילות יש חשיבות רבה במיוחד בהשוואת ביטוי גנים בין דגימות. שיטת ΔΔCt המקובלת לחישוב שינוי הקיפול מניחה שכל תגובה מתרחשת ביעילות של 100%. כאשר היעילות הנמדדת שונה מ-100%, או כאשר לגן מטרה ולגן ייחוס יש יעילויות שונות, תוצאות שינוי הקיפול עלולות להיות לא מדויקות.

נוסחת יעילות qPCR

היעילות מחושבת על פי שיפוע עקומת הכיול, קו שנוצר משרטוט ערכי Ct מול הלוגריתם בבסיס 10 (log10) של כמות ה-DNA ההתחלתית בסדרת מיהולים.

E = 10^(-1/שיפוע) - 1

E היא היעילות, המבוטאת כמספר עשרוני (יש להכפיל ב-100 כדי לקבל אחוזים). השיפוע הוא שיפוע קו עקומת הכיול. הוא שלילי, משום ש-Ct עולה ככל שכמות ה-DNA ההתחלתית יורדת.

שיפוע של -3.32 מתאים ליעילות של 100%:

10^(-1/-3.32) - 1 = 10^0.301–1 ≈ 1.00

הדבר נובע מכך שמיהול פי 10 אמור להזיז את Ct בכ-3.32 מחזורים אם התגובה מכפילה את ה-DNA בכל מחזור, משום ש-log2(10) הוא בקירוב 3.32.

בפועל, שיפוע שבין -3.1 ל--3.6 נחשב קביל. טווח זה מתאים ליעילות של בערך 90% עד 110%. שיפוע הקרוב יותר ל--3.1 נותן יעילות מחושבת גבוהה יותר; שיפוע הקרוב יותר ל--3.6 נותן יעילות נמוכה יותר.

כיצד לחשב יעילות qPCR: שיטת עקומת הכיול

1. הכינו סדרת מיהולים. התחילו בדגימה המרוכזת ביותר ודללו אותה בגורם קבוע, בדרך כלל פי 10, עבור כל דגימה עוקבת. בצעו qPCR בכל מיהול ותעדו את ערך ה-Ct שלו.
2. המירו כל מיהול לערך log10. אם סופרים את הדגימה הראשונה והמרוכזת ביותר כמיקום 0, לדגימה מספר i יש log10(כמות יחסית) השווה ל--i × log10(גורם המיהול).
3. שרטטו את Ct (הציר האנכי) מול ערך ה-log10 (הציר האופקי) עבור כל מיהול ובצעו רגרסיה ליניארית.
4. קראו את השיפוע, את החיתוך ואת R² של קו הרגרסיה.
5. הציבו את השיפוע בנוסחה E = 10^(-1/שיפוע) - 1 כדי לקבל את היעילות.

קריטריונים לאיכות עקומת הכיול

• R² של לפחות 0.98. מדד זה בוחן עד כמה הנקודות מתאימות לקו ישר. ערך נמוך יותר מצביע לעיתים קרובות על שגיאות פיפטור או על הגברה לא עקבית.
• שיפוע בין -3.1 ל--3.6. טווח זה מתאים ליעילות של 90–110%.
• לפחות שלוש נקודות מיהול. חמש או שש נקודות נותנות קו מהימן יותר ומקלות על זיהוי נקודה חריגה.
• הדגימה המרוכזת ביותר צריכה לתת Ct סביב 15-20. הדגימה המדוללת ביותר צריכה להישאר מתחת ל-Ct 35, משום שערכים מעל לכך מתקרבים לגבול הגילוי.

דוגמה פתורה

סדרת מיהולים בת חמש נקודות, במיהול של פי 10, נותנת את ערכי ה-Ct הבאים, מהמרוכזת ביותר לדלילה ביותר: 15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0.

ערכי log10(כמות יחסית) הם 0, -1, -2, -3, -4, משום שכל שלב מיהול מוסיף ‎-log10(10), כלומר -1. Ct עולה ב-3.5 מחזורים בכל שלב, ולכן הנקודות נמצאות על קו ישר והרגרסיה הליניארית נותנת:

• שיפוע: -3.5
• חיתוך: 15.0
• R²: 1.0

יעילות: E = 10^(-1/-3.5) - 1 = 10^0.286–1 ≈ 0.931, או בערך 93%.

יעילות של 93% עם R² = 1.0 עומדת בקריטריוני האיכות המקובלים ומתאימה לכימות ביטוי גנים.

דוגמת קוד

פונקציית JavaScript זו פועלת לפי אותה שיטה כמו המחשבון. האינדקס של כל ערך Ct הופך לשלילי לפני חישוב הלוגריתם, משום שלדגימה הראשונה והמרוכזת ביותר יש את הכמות היחסית הגבוהה ביותר, וכל דגימה עוקבת מדוללת יותר.

1function qpcrEfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
2  // Sample 0 is most concentrated; each later sample is diluted further,
3  // so its log10(relative quantity) is negative.
4  const x = ctValues.map((_, i) => -i * Math.log10(dilutionFactor));
5  const n = ctValues.length;
6  let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0;
7  for (let i = 0; i < n; i++) {
8    sumX += x[i];
9    sumY += ctValues[i];
10    sumXY += x[i] * ctValues[i];
11    sumXX += x[i] * x[i];
12  }
13  const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
14  const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
15  const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
16  return { efficiency, slope, intercept };
17}
18
19qpcrEfficiency([15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0], 10);
20// => { efficiency: 93.07, slope: -3.5, intercept: 15 }
21

מדוע היעילות חשובה לביטוי גנים

חישובי שינוי קיפול, כולל שיטת ΔΔCt, מניחים שכל תגובה מכפילה את המטרה שלה בכל מחזור. כאשר לגן מטרה ולגן ייחוס יש יעילויות נמדדות שונות, נוסחת ΔΔCt הפשוטה גורמת לשגיאה. חוקרים עוברים לעיתים קרובות לחישוב מתוקן-יעילות, כגון השיטה שתיאר Michael Pfaffl בשנת 2001, כאשר היעילויות שונות ביותר מחמש נקודות אחוז בקירוב. הנחיות MIQE, אוסף תקני דיווח המצוטט רבות עבור qPCR, שפורסם בשנת 2009, ממליצות שמחקרים ידווחו על היעילות המחושבת, השיפוע ו-R² לצד תוצאות הכימות.

שאלות נפוצות

מהו אחוז יעילות qPCR טוב?

טווח שבין 90% ל-110% מקובל בדרך כלל, כאשר בדיקות שעברו אופטימיזציה טובה מגיעות לכ-95–105%. שיפוע של -3.32 מתאים בדיוק ל-100%.

מדוע יעילות ה-qPCR שלי גבוהה מ-110%?

גורמים שכיחים כוללים שגיאות פיפטור בסדרת המיהולים, דימרי פריימרים, מעכבים המשפיעים באופן לא שווה על דגימות מרוכזות ומדוללות, או סף פלואורסצנציה שנקבע מחוץ לשלב האקספוננציאלי של ההגברה. עקומת התכה עם יותר משיא אחד עשויה להצביע על דימרי פריימרים.

מדוע יעילות ה-qPCR שלי נמוכה מ-90%?

גורמים אפשריים כוללים תכנון פריימרים לקוי, מעכבי PCR שנותרו ממיצוי הדגימה, או טמפרטורת איחוי שאינה מיטבית. בדיקת הספציפיות של הפריימרים והרצת מפל טמפרטורות עשויות לסייע באיתור הגורם.

מה מציין ערך R² נמוך?

R² מודד עד כמה ערכי Ct מתאימים לקו ישר ביחס לכמות הלוגריתמית. ערך מתחת ל-0.98 מצביע על אי-עקביות בפיפטור, דגימה מעוכבת או נקודת מיהול הקרובה לגבול הגילוי.

לכמה נקודות מיהול זקוקה עקומת כיול?

לפחות שלוש, המינימום הדרוש לרגרסיה ליניארית. חמש או שש נקודות נותנות שיפוע מהימן יותר ומקלות על זיהוי נקודות חריגות.

האם היעילות יכולה להשתנות בין ניסויים?

כן. אצווה חדשה של ריאגנטים, אצווה חדשה של פריימרים, סוג דגימה שונה או מכשיר qPCR אחר עשויים לשנות את היעילות. מעבדות רבות בודקות מחדש את היעילות מדי כמה חודשים או עם כל אצווה חדשה של ריאגנטים.

מקורות

1. Bustin SA, Benes V, Garson JA ואח'. הנחיות MIQE: מידע מינימלי לפרסום ניסויי PCR כמותי בזמן אמת. Clinical Chemistry. 2009;55(4):611-622.
2. Pfaffl MW. מודל מתמטי חדש לכימות יחסי ב-RT-PCR בזמן אמת. Nucleic Acids Research. 2001;29(9):e45.
3. Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. עד כמה מדויק אומדן יעילות PCR: המלצות להערכות מדויקות של יעילות qPCR. Biomolecular Detection and Quantification. 2015;3:9-16.