חשב את יעילות ה-PCR מתוך ערכי Ct ופקטורי דילול. נתח עקומות סטנדרטיות, קבע את יעילות האמפליפיקציה ואמת את ניסויי ה-qPCR הכמותיים שלך.
הערך חייב להיות חיובי
הערך חייב להיות חיובי
הערך חייב להיות חיובי
הערך חייב להיות חיובי
הערך חייב להיות חיובי
הזן נתונים תקינים כדי ליצור תרשים
יעילות qPCR היא מדד לאופן שבו התגובה של PCR מתבצעת. יעילות של 100% פירושה שכמות המוצר של PCR מוכפלת בכל מחזור במהלך השלב האקספוננציאלי.
היעילות מחושבת משיפוע עקומת התקן, המתקבלת על ידי ציור ערכי Ct מול הלוגריתם של ריכוז התבנית ההתחלתית (סדרת דילול).
היעילות (E) מחושבת באמצעות הנוסחה:
E = 10^(-1/slope) - 1
יעילות ה-PCR הכמותי (qPCR) היא פרמטר קריטי שמשפיע ישירות על הדיוק והאמינות של ניסויי ה-qPCR שלך. מחשבון יעילות ה-qPCR עוזר לחוקרים לקבוע עד כמה ה-Reactions ה-PCR שלהם מגבירים את רצפי ה-DNA המטרה ביעילות עם כל מחזור חום. ה-Reactions qPCR האידיאליים צריכים להיות עם יעילות בין 90-110%, מה שמעיד על כך שכמות המוצר ה-PCR כמעט מכפילה את עצמה עם כל מחזור במהלך השלב האקספוננציאלי.
יעילות הגברה ירודה יכולה להוביל לכימות לא מדויק, תוצאות לא אמינות ומסקנות ניסיוניות שגויות. על ידי חישוב ומעקב אחר יעילות ה-qPCR שלך, תוכל לאופטימיזציה של תנאי ה-Reaction, לאמת עיצובים של פריימרים ולוודא את איכות נתוני ה-PCR הכמותי שלך.
מחשבון זה משתמש בשיטת עקומת הסטנדרט, שמשרטטת ערכי סף מחזור (Ct) מול הלוגריתם של ריכוז התבנית (המוצג על ידי דילולים סדרתיים), כדי לקבוע את היעילות של ניסוי ה-qPCR שלך. השיפוע الناتן של עקומת הסטנדרט הזו משמש לאחר מכן לחישוב יעילות ההגברה באמצעות נוסחה מתמטית פשוטה.
יעילות ה-Reaction של qPCR מחושבת מהשיפוע של עקומת הסטנדרט באמצעות הנוסחה הבאה:
איפה:
ל-Reaction PCR אידיאלי עם 100% יעילות (הכפלה מושלמת של האמפלקונים עם כל מחזור), השיפוע יהיה -3.32. זה בגלל:
10^{(-1/-3.32)} - 1 = 10^{0.301} - 1 = 2 - 1 = 1.0 \text{ (או 100%)}
אחוז היעילות מחושב על ידי הכפלת היעילות העשרונית ב-100:
\text{Efficiency (%)} = E \times 100\%
עקומת הסטנדרט נוצרת על ידי משרטוט ערכי Ct (ציר y) מול הלוגריתם של ריכוז התבנית ההתחלתי או גורם הדילול (ציר x). הקשר בין משתנים אלו צריך להיות ליניארי, ואיכות הקשר הליניארי הזה מוערכת באמצעות מקדם ההחלטה (R²).
לצורך חישובי יעילות qPCR מהימנים:
הכנת נתונים: המחשבון לוקח את ערכי ה-Ct שלך עבור כל נקודת דילול ואת גורם הדילול כקלטים.
טרנספורמציה לוגאריתמית: סדרת הדילול מומרת לסקלה לוגריתמית (לוגריתם בסיס 10).
רגרסיה ליניארית: המחשבון מבצע ניתוח רגרסיה ליניארית על הנתונים המומרצים לוגריתמית כדי לקבוע את השיפוע, החיתוך וערך R².
חישוב יעילות: באמצעות ערך השיפוע, היעילות מחושבת באמצעות הנוסחה E = 10^(-1/slope) - 1.
פרשנות תוצאות: המחשבון מציג את היעילות כאחוז, יחד עם השיפוע וערך R² כדי לעזור לך להעריך את מהימנות ניסוי ה-qPCR שלך.
עקוב אחרי הצעדים הבאים כדי לחשב את יעילות ה-qPCR שלך:
קבע את מספר הדילולים: בחר כמה נקודות דילול יש לך בעקומת הסטנדרט (מומלץ בין 3-7 נקודות).
הזן את גורם הדילול: הזן את גורם הדילול ששימש בין דגימות עוקבות (למשל, 10 עבור סדרת דילול של 10, 5 עבור סדרת דילול של 5).
הזן ערכי Ct: הזן את ערכי ה-Ct עבור כל נקודת דילול. בדרך כלל, הדילול הראשון (דילול 1) מכיל את הריכוז הגבוה ביותר של תבנית, מה שמוביל לערך Ct הנמוך ביותר.
צפה בתוצאות: המחשבון יחיש אוטומטית ויציג:
פרש את התוצאות: הערך אם היעילות של ה-qPCR שלך נופלת בטווח המקובל (90-110%) ואם ערך R² מעיד על עקומת סטנדרט מהימנה (≥ 0.98).
העתק תוצאות: השתמש בכפתור "העתק תוצאות" כדי להעתיק את כל הערכים המחושבים לרשומות או לפרסומים שלך.
בואו נעבור על דוגמה:
כאשר נשרטט על עקומת הסטנדרט:
המחשבון יבצע רגרסיה ליניארית ויקבע:
באמצעות נוסחת היעילות:
זה מעיד על יעילות qPCR טובה של 93%, שנופלת בטווח המקובל של 90-110%.
לפני השימוש בזוג פריימרים חדש לניסויים כמותיים, חשוב לאמת את הביצועים שלו. חישוב יעילות qPCR עוזר:
בעת פיתוח ניסויי qPCR חדשים, חישובי יעילות הם קריטיים ל:
בניסויים בכימות יחסית, ידיעת יעילות ה-PCR חיונית ל:
בהגדרות קליניות ודיאגנוסטיות, יעילות qPCR חשובה ל:
ליישומים סביבתיים ובטיחות מזון, חישובי יעילות עוזרים:
בעוד ששיטת עקומת הסטנדרט היא הגישה הנפוצה ביותר לחישוב יעילות qPCR, ישנן שיטות חלופיות:
שיטה זו מחשבת את היעילות מנתוני הפלואורסצנציה של עקומת אמפליקציה בודדת, מבלי לדרוש סדרת דילול. תוכנה כמו LinRegPCR מנתחת את השלב האקספוננציאלי של תגובות בודדות כדי לקבוע יעילות.
יתרונות:
חסרונות:
PCR דיגיטלי (dPCR) מספק כימות מוחלט מבלי לדרוש עקומת סטנדרט או חישובי יעילות.
יתרונות:
חסרונות:
חלק מתוכנות ניתוח qPCR מציעות שיטות כימות השוואתיות שמעריכות יעילות מבלי לדרוש עקומת סטנדרט מלאה.
יתרונות:
חסרונות:
הפיתוח של qPCR וחישובי יעילות התפתח באופן משמעותי במהלך העשורים האחרונים:
ה-Reaction של פולימראז שרשרת (PCR) הומצא על ידי קארי מוליס בשנת 1983, מהפכה את הביולוגיה המולקולרית. עם זאת, PCR המסורתי היה רק איכותי או חצי-כמותי. מערכת ה-PCR בזמן אמת הראשונה פותחה בתחילת שנות ה-90 על ידי ראסל היגוצ'י וחבריו, שהראו כי מעקב אחר מוצרים ה-PCR ככל שהם מצטברים (באמצעות פלואורסצנציה של אתידיום ברומיד) יכול לספק מידע כמותי.
כשהטכנולוגיה של qPCR התקדמה, חוקרים הכירו בחשיבות הסטנדרטיזציה והאימות. המושג של יעילות PCR הפך למרכזי לכימות מהימן:
התחום המשיך להתפתח עם:
היום, חישוב ודיווח על יעילות qPCR נחשב חיוני לפרסום נתוני qPCR מהימנים, וכלים כמו המחשבון הזה עוזרים לחוקרים לעמוד בסטנדרטים הטובים ביותר בתחום.
1' נוסחת Excel לחישוב יעילות qPCR מהשיפוע
2' הנח ב-cell B2 אם השיפוע נמצא ב-cell A2
3=10^(-1/A2)-1
4
5' נוסחת Excel להמרת יעילות לאחוז
6' הנח ב-cell C2 אם היעילות העשרונית נמצאת ב-cell B2
7=B2*100
8
9' פונקציה לחישוב יעילות מנת ערכי Ct וגורם דילול
10Function qPCR_Efficiency(CtValues As Range, DilutionFactor As Double) As Double
11 Dim i As Integer
12 Dim n As Integer
13 Dim sumX As Double, sumY As Double, sumXY As Double, sumXX As Double
14 Dim logDilution As Double, slope As Double
15
16 n = CtValues.Count
17
18 ' חישוב רגרסיה ליניארית
19 For i = 1 To n
20 logDilution = (i - 1) * WorksheetFunction.Log10(DilutionFactor)
21 sumX = sumX + logDilution
22 sumY = sumY + CtValues(i)
23 sumXY = sumXY + (logDilution * CtValues(i))
24 sumXX = sumXX + (logDilution * logDilution)
25 Next i
26
27 ' חישוב שיפוע
28 slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX)
29
30 ' חישוב יעילות
31 qPCR_Efficiency = (10 ^ (-1 / slope) - 1) * 100
32End Function
331# פונקציית R לחישוב יעילות qPCR מנת ערכי Ct וגורם דילול
2calculate_qpcr_efficiency <- function(ct_values, dilution_factor) {
3 # יצירת ערכי דילול לוגריתמיים
4 log_dilutions <- log10(dilution_factor) * seq(0, length(ct_values) - 1)
5
6 # ביצוע רגרסיה ליניארית
7 model <- lm(ct_values ~ log_dilutions)
8
9 # חילוץ שיפוע ו-R-squared
10 slope <- coef(model)[2]
11 r_squared <- summary(model)$r.squared
12
13 # חישוב יעילות
14 efficiency <- (10^(-1/slope) - 1) * 100
15
16 # החזרת תוצאות
17 return(list(
18 efficiency = efficiency,
19 slope = slope,
20 r_squared = r_squared,
21 intercept = coef(model)[1]
22 ))
23}
24
25# דוגמת שימוש
26ct_values <- c(15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0)
27dilution_factor <- 10
28results <- calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
29cat(sprintf("Efficiency: %.2f%%\n", results$efficiency))
30cat(sprintf("Slope: %.4f\n", results$slope))
31cat(sprintf("R-squared: %.4f\n", results$r_squared))
321import numpy as np
2from scipy import stats
3import matplotlib.pyplot as plt
4
5def calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor):
6 """
7 Calculate qPCR efficiency from Ct values and dilution factor.
8
9 Parameters:
10 ct_values (list): List of Ct values
11 dilution_factor (float): Dilution factor between consecutive samples
12
13 Returns:
14 dict: Dictionary containing efficiency, slope, r_squared, and intercept
15 """
16 # Create log dilution values
17 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
18
19 # Perform linear regression
20 slope, intercept, r_value, p_value, std_err = stats.linregress(log_dilutions, ct_values)
21
22 # Calculate efficiency
23 efficiency = (10 ** (-1 / slope) - 1) * 100
24 r_squared = r_value ** 2
25
26 return {
27 'efficiency': efficiency,
28 'slope': slope,
29 'r_squared': r_squared,
30 'intercept': intercept
31 }
32
33def plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results):
34 """
35 Plot the standard curve with regression line.
36 """
37 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
38
39 plt.figure(figsize=(10, 6))
40 plt.scatter(log_dilutions, ct_values, color='blue', s=50)
41
42 # Generate points for regression line
43 x_line = np.linspace(min(log_dilutions) - 0.5, max(log_dilutions) + 0.5, 100)
44 y_line = results['slope'] * x_line + results['intercept']
45 plt.plot(x_line, y_line, 'r-', linewidth=2)
46
47 plt.xlabel('Log Dilution')
48 plt.ylabel('Ct Value')
49 plt.title('qPCR Standard Curve')
50
51 # Add equation and R² to plot
52 equation = f"y = {results['slope']:.4f}x + {results['intercept']:.4f}"
53 r_squared = f"R² = {results['r_squared']:.4f}"
54 efficiency = f"Efficiency = {results['efficiency']:.2f}%"
55
56 plt.annotate(equation, xy=(0.05, 0.95), xycoords='axes fraction')
57 plt.annotate(r_squared, xy=(0.05, 0.90), xycoords='axes fraction')
58 plt.annotate(efficiency, xy=(0.05, 0.85), xycoords='axes fraction')
59
60 plt.grid(True, linestyle='--', alpha=0.7)
61 plt.tight_layout()
62 plt.show()
63
64# דוגמת שימוש
65ct_values = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0]
66dilution_factor = 10
67results = calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
68
69print(f"Efficiency: {results['efficiency']:.2f}%")
70print(f"Slope: {results['slope']:.4f}")
71print(f"R-squared: {results['r_squared']:.4f}")
72print(f"Intercept: {results['intercept']:.4f}")
73
74# צייר את עקומת הסטנדרט
75plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results)
761/**
2 * Calculate qPCR efficiency from Ct values and dilution factor
3 * @param {Array<number>} ctValues - Array of Ct values
4 * @param {number} dilutionFactor - Dilution factor between consecutive samples
5 * @returns {Object} Object containing efficiency, slope, rSquared, and intercept
6 */
7function calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
8 // Create log dilution values
9 const logDilutions = ctValues.map((_, index) => index * Math.log10(dilutionFactor));
10
11 // Calculate means for linear regression
12 const n = ctValues.length;
13 let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0, sumYY = 0;
14
15 for (let i = 0; i < n; i++) {
16 sumX += logDilutions[i];
17 sumY += ctValues[i];
18 sumXY += logDilutions[i] * ctValues[i];
19 sumXX += logDilutions[i] * logDilutions[i];
20 sumYY += ctValues[i] * ctValues[i];
21 }
22
23 // Calculate slope and intercept
24 const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
25 const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
26
27 // Calculate R-squared
28 const yMean = sumY / n;
29 let totalVariation = 0;
30 let explainedVariation = 0;
31
32 for (let i = 0; i < n; i++) {
33 const yPredicted = slope * logDilutions[i] + intercept;
34 totalVariation += Math.pow(ctValues[i] - yMean, 2);
35 explainedVariation += Math.pow(yPredicted - yMean, 2);
36 }
37
38 const rSquared = explainedVariation / totalVariation;
39
40 // Calculate efficiency
41 const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
42
43 return {
44 efficiency,
45 slope,
46 rSquared,
47 intercept
48 };
49}
50
51// דוגמת שימוש
52const ctValues = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0];
53const dilutionFactor = 10;
54const results = calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor);
55
56console.log(`Efficiency: ${results.efficiency.toFixed(2)}%`);
57console.log(`Slope: ${results.slope.toFixed(4)}`);
58console.log(`R-squared: ${results.rSquared.toFixed(4)}`);
59console.log(`Intercept: ${results.intercept.toFixed(4)}`);
60יעילות qPCR טובה בדרך כלל נופלת בין 90% ל-110% (0.9-1.1). יעילות של 100% מייצגת הכפלה מושלמת של המוצר ה-PCR עם כל מחזור. יעילויות מחוץ לטווח זה עשויות להעיד על בעיות בעיצוב פריימרים, תנאי תגובה או נוכחות של מעכבים.
יעילויות גבוהות מ-100% יכולות להתרחש בגלל:
ערך R² נמוך (מתחת ל-0.98) מעיד על חוסר ליניאריות בעקומת הסטנדרט שלך, מה שעשוי להיגרם על ידי:
לצורך חישובי יעילות מהימנים, יש צורך במינימום של 3 נקודות דילול, אך מומלץ 5-6 נקודות לתוצאות מדויקות יותר. נקודות אלו צריכות לכסות את כל טווח הריכוזים הצפויים בדגימות הניסוי שלך.
בכימות יחסית באמצעות שיטת ΔΔCt, מניחים יעילות שווה בין גנים מטרה וגני רפרנס (אידיאלית 100%). כאשר היעילות שונה באופן משמעותי:
לא, יש לקבוע את היעילות עבור כל זוג פריימרים ויש לאמת אותה מחדש:
מעכבים ב-PCR יכולים:
המונחים משמשים לעיתים לסירוגין, אך:
כדי לשפר את יעילות ה-qPCR:
השוואת דגימות עם יעילויות שונות באופן משמעותי אינה מומלצת כי:
Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. doi:10.1373/clinchem.2008.112797
Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45. doi:10.1093/nar/29.9.e45
Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments. Biomol Detect Quantif. 2015;3:9-16. doi:10.1016/j.bdq.2015.01.005
Taylor SC, Nadeau K, Abbasi M, Lachance C, Nguyen M, Fenrich J. The Ultimate qPCR Experiment: Producing Publication Quality, Reproducible Data the First Time. Trends Biotechnol. 2019;37(7):761-774. doi:10.1016/j.tibtech.2018.12.002
Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, et al. Amplification efficiency: linking baseline and bias in the analysis of quantitative PCR data. Nucleic Acids Res. 2009;37(6):e45. doi:10.1093/nar/gkp045
Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y). 1993;11(9):1026-1030. doi:10.1038/nbt0993-1026
Bio-Rad Laboratories. Real-Time PCR Applications Guide. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5279.pdf
Thermo Fisher Scientific. Real-Time PCR Handbook. https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-handbook.pdf
המחשבון שלנו לחישוב יעילות qPCR מספק כלי פשוט אך רב עוצמה לחוקרים לאמת ולאופטימיזציה של ניסויי ה-PCR הכמותי שלהם. על ידי חישוב מדויק של יעילות מעקומות סטנדרט, תוכל להבטיח כימות מהימן, לפתור ניסויים בעייתיים ולעמוד בסטנדרטים הטובים ביותר בניסוי qPCR.
נסה את המחשבון שלנו היום כדי לשפר את איכות ואמינות נתוני ה-qPCR שלך!
גלה עוד כלים שעשויים להיות שימושיים עבור זרימת העבודה שלך