מחשבון מספר עותקי DNA | כלי לניתוח גנומי

מחשבון מספר העותקים של DNA

מחשבון מספר העותקים של DNA מעריך כמה עותקים של רצף מטרה קיימים בדגימת DNA. הוא פועל על סמך ריכוז הדגימה, נפחה והתדירות שבה רצף המטרה מופיע בתוך רצף ה-DNA הגדול יותר. מעבדות לביולוגיה מולקולרית משתמשות בהערכה כזאת כדי לתכנן ניסויים כגון qPCR (תגובת שרשרת של פולימראז כמותית) לפני ביצוע בדיקה יקרה ומדויקת יותר.

מה משמעות מספר העותקים של DNA

מספר העותקים של DNA הוא מספר הפעמים שרצף מסוים מופיע בגנום או בדגימה. גן אנושי טיפוסי מופיע פעמיים, פעם אחת בתורשה מכל אחד מההורים. כמה גורמים יכולים לשנות את המספר הזה.

• הגברה: יותר משני עותקים. תאים סרטניים מגבירים לעיתים קרובות גנים המקדמים גדילה, כגון HER2 בחלק מגידולי השד.
• מחיקה: פחות משני עותקים, ולעיתים אפס. מחיקות עלולות לגרום להפרעות גנטיות.
• הכפלה: עותק נוסף מופיע במקום שבו אמור להופיע עותק אחד או שני עותקים.
• שונות במספר העותקים (CNV): הבדל תקין במספר העותקים בין פרטים, הנמצא בחלק משמעותי מהגנום האנושי.

נוסחה לחישוב מספר העותקים של DNA

המחשבון ממיר את מספר מופעי הרצף ואת מסת הדגימה למספר עותקים באמצעות הנוסחה הזאת:

$\text{מספר העותקים} = \frac{\text{מופעים} \times \text{ריכוז} \times \text{נפח} \times N_A}{\text{אורך ה-DNA} \times 660 \times 10^{9}}$

כאשר:

• מופעים — כמה פעמים רצף המטרה מופיע ברצף ה-DNA המלא, כאשר התאמות חופפות נספרות בנפרד.
• ריכוז — ריכוז ה-DNA בננוגרמים למיקרוליטר (ng/μL), הנמדד בדרך כלל באמצעות ספקטרופוטומטר או פלואורומטר.
• נפח — נפח הדגימה במיקרוליטרים (μL).
• $N_A$ — מספר אבוגדרו, 6.022 × 10²³ מולקולות למול. הוא ממיר מולים של DNA למספר מולקולות.
• אורך ה-DNA — אורך רצף ה-DNA המלא, בזוגות בסיסים.
• 660 — המסה המולקולרית הממוצעת של זוג בסיסים אחד ב-DNA, בגרמים למול (g/mol). זוג בסיסים מורכב משני נוקלאוטידים מזווגים, אחד מכל גדיל DNA.
• 10⁹ — ממיר ננוגרמים לגרמים.

הנוסחה ממירה תחילה את מסת הדגימה למולים של מולקולות DNA, מכפילה במספר אבוגדרו כדי לקבל את המספר הכולל של מולקולות DNA בדגימה, ואז מכפילה במספר הפעמים שרצף המטרה מופיע בכל מולקולה.

הכלי מקבל רק את האותיות A, T, C ו-G. מתעלמים מרווחים וממעברי שורה, ואותיות קטנות נספרות כמו אותיות גדולות.

כיצד לחשב את מספר העותקים של DNA: דוגמה פתורה

נתבונן ברצף DNA באורך 12 זוגות בסיסים, ATCGATCGATCG, שבו רצף המטרה הוא ATCG, הריכוז הוא 10 ng/μL והנפח הוא 20 μL.

שלב 1: ספירת המופעים. ATCG מופיע 3 פעמים בתוך ATCGATCGATCG (במיקומים 1, 5 ו-9).

שלב 2: מציאת מסת ה-DNA הכוללת. ריכוז × נפח = 10 × 20 = 200 ng.

שלב 3: המרה למולים. 200 ng = 2 × 10⁻⁷ g. מחלקים ב-(12 זוגות בסיסים × 660 g/mol) = 7,920 g/mol. מתקבלים 2.53 × 10⁻¹¹ mol.

שלב 4: המרה למספר מולקולות. מכפילים במספר אבוגדרו: 2.53 × 10⁻¹¹ mol × 6.022 × 10²³ molecules/mol ≈ 1.52 × 10¹³ מולקולות DNA.

שלב 5: הכפלה במספר המופעים. 3 × 1.52 × 10¹³ ≈ 4.56 × 10¹³, כלומר בערך 45,621,212,121,212 עותקים.

המספר הזה נראה עצום משום שגם דגימה בנפח 20 μL ובריכוז 10 ng/μL עדיין מכילה טריליוני מולקולות DNA קצרות. בדגימות אמיתיות משתמשים בדרך כלל ברצפים ארוכים בהרבה, ולכן מספר המולקולות קטן יותר עבור אותה מסה.

היכן משתמשים בניתוח מספר העותקים של DNA

אבחון סרטן. מעבדות לפתולוגיה בודקות את מספר העותקים של HER2 ברקמת גידול השד. תא תקין נושא שני עותקים. גידול עם הגברה יכול לשאת שישה עותקים או יותר, דבר המשפיע על ההתאמה לתרופות ממוקדות כגון טרסטוזומאב.

בדיקת מחלות גנטיות. מצבים כגון תסמונת די-ג'ורג' כוללים מחיקה של מקטע כרומוזום. תסמונת דאון כוללת עותק נוסף של כרומוזום 21 (טריזומיה 21). ספירת העותקים מסייעת לאשר אבחנות אלה.

כימות טרנסגנים ופלסמידים. חוקרים בודקים כמה עותקים של גן שהוחדר נקלטו בתא של צמח, בעל חיים או חיידק. בדרך כלל מעדיפים עותק יחיד, משום שעותקים מרובים עלולים לגרום לתא להשתיק את הגן.

ניטור פתוגנים ועומס נגיפי. הערכות של מספר העותקים עוקבות אחר כמות ה-DNA הנגיפי או החיידקי הנמצאת בדגימה, ומשמשות לניטור זיהומים ולבדיקות סביבתיות.

שיטות אחרות למדידת מספר העותקים

מחשבון זה מספק הערכה מהירה על סמך נתוני הרצף והריכוז. מעבדות הזקוקות לדיוק רב יותר משתמשות בדרך כלל באחת מהשיטות הבאות:

• PCR כמותי (qPCR): מגביר ומודד DNA בזמן אמת; הדיוק הוא בערך 15–20% עם עקומת כיול תקינה.
• PCR דיגיטלי (dPCR): מחלק דגימה לאלפי תגובות זעירות לצורך ספירה ישירה, ללא צורך בעקומת כיול.
• הכלאה פלואורסצנטית באתר (FISH): מאפשרת לספור רצפים באופן חזותי במיקרוסקופ ישירות בתאים או בכרומוזומים; זו השיטה המקובלת במעבדות רבות לאבחון סרטן.
• ריצוף מהדור הבא (NGS): מרצף את הדגימה כולה ומאפיין את מספר העותקים ברחבי הגנום בבת אחת.

שאלות נפוצות

מהו מספר העותקים של DNA? זהו מספר הפעמים שרצף DNA נתון מופיע בגנום או בדגימה. רוב הגנים האנושיים מופיעים פעמיים, פעם אחת מכל הורה. עותקים נוספים או חסרים עלולים להשפיע על הבריאות ועל הסיכון למחלות.

עד כמה המחשבון הזה מדויק? הוא מספק הערכה תאורטית המבוססת על הנתונים שהוזנו, ולא מדידה מעבדתית. הדיוק תלוי במידת הדיוק שבה נמדד הריכוז ובמידת הספציפיות של רצף המטרה. שיטות כגון PCR דיגיטלי מדויקות יותר עבור תוצאות המתפרסמות.

האם אפשר להשתמש במחשבון הזה עבור RNA? לא. ב-RNA יש אוראציל במקום תימין וסוכר אחר, ולכן המסה המולקולרית שלו שונה מזו של DNA. ל-RNA יש מסה מולקולרית ממוצעת של כ-330 g/mol לכל נוקלאוטיד, לעומת כ-660 g/mol לכל זוג בסיסים ב-DNA. שימוש בנוסחת ה-DNA עם נתוני RNA ייתן תשובה שגויה.

מדוע רצף חופף נספר יותר מפעם אחת? המחשבון סופר כל מיקום שבו רצף המטרה תואם, גם אם ההתאמות חולקות אותיות. בתוך ATATAT, הרצף ATA תואם פעמיים, במיקום 1 ובמיקום 3, משום שכל מיקום התחלה נבדק בנפרד.

איזה טווח ריכוזי DNA נותן את התוצאות הטובות ביותר? ריכוזים של 10–100 ng/μL מספקים את המדידות האמינות ביותר במכשירי מעבדה רגילים. מתחת ל-10 ng/μL, שגיאת המדידה גדלה, ומומלץ להשתמש בשיטה רגישה יותר כגון פלואורומטר במקום בספקטרופוטומטר רגיל.

האם המחשבון הזה יכול להעריך את מספר העותקים של פלסמיד? כן. יש להזין את רצף הפלסמיד המלא כרצף ה-DNA, ואזור ייחודי של המקטע שהוחדר כרצף המטרה, יחד עם ריכוז הפלסמיד שנמדד ונפח הדגימה.