เครื่องคำนวณกิจกรรมเอนไซม์ - จลนศาสตร์ของไมเคลิส-เมนเทน

เครื่องคำนวณกิจกรรมของเอนไซม์

เครื่องคำนวณกิจกรรมของเอนไซม์ใช้หาความเร็วที่เอนไซม์เปลี่ยนสารตั้งต้นเป็นผลิตภัณฑ์ โดยแสดงเป็นกิจกรรมจำเพาะในหน่วยต่อมิลลิกรัม (U/mg) เครื่องมือนี้ใช้สมการไมเคิลิส–เมนเทน ซึ่งเป็นแบบจำลองมาตรฐานของจลนพลศาสตร์ของเอนไซม์ ร่วมกับปริมาณโปรตีนเอนไซม์ในตัวอย่าง

เอนไซม์เป็นโปรตีนที่เร่งปฏิกิริยาเคมีในเซลล์โดยไม่ถูกใช้หมด นักวิทยาศาสตร์วัดว่าเอนไซม์มีความว่องไวเพียงใดเพื่อเปรียบเทียบสารละลายเอนไซม์ต่างชุด ตรวจสอบว่าขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ได้ผลหรือไม่ หรือทดสอบว่ายามีผลต่อความเร็วของเอนไซม์อย่างไร ตัวเลขความเข้มข้นของเอนไซม์เพียงอย่างเดียวไม่ได้บอกว่าเอนไซม์นั้นทำงานได้ดีหรือไม่ แต่กิจกรรมจำเพาะบอกได้

เครื่องคำนวณหาค่าอะไร

เครื่องมือนี้รับข้อมูล 5 ค่า ได้แก่ ความเข้มข้นของเอนไซม์ ความเข้มข้นของสารตั้งต้น ค่าคงที่ไมเคิลิส (Km) อัตราเร็วสูงสุด (Vmax) และเวลาที่เกิดปฏิกิริยา เวลาที่เกิดปฏิกิริยาบันทึกไว้เพื่อใช้อ้างอิง แต่ไม่ได้อยู่ในสูตร อัตราเร็วสูงสุด (Vmax) เป็นอัตราอยู่แล้ว คือปริมาณสารตั้งต้นที่เปลี่ยนต่อหนึ่งนาที ดังนั้นเวลาจึงถูกรวมอยู่ในค่านี้แล้ว การหารด้วยเวลาอีกครั้งจะเป็นการนับเวลาซ้ำ

เครื่องคำนวณแสดงผลเป็นตัวเลขหนึ่งค่าและกราฟหนึ่งกราฟ:

• กิจกรรมจำเพาะ ในหน่วย U/mg คืออัตราเร็วของปฏิกิริยาหารด้วยปริมาณโปรตีนเอนไซม์ที่มีอยู่
• กราฟแสดงอัตราเร็วของปฏิกิริยาเทียบกับความเข้มข้นของสารตั้งต้น โดยแสดงช่วงต่ำ ช่วงเปลี่ยนผ่าน และช่วงอิ่มตัวของเส้นโค้ง พร้อมทำเครื่องหมายอัตราเร็วที่ความเข้มข้นของสารตั้งต้นที่ป้อน

วิธีคำนวณกิจกรรมของเอนไซม์

สมการไมเคิลิส–เมนเทน

Leonor Michaelis และ Maud Menten เผยแพร่แบบจำลองนี้ในปี 1913 แบบจำลองนี้อธิบายว่าอัตราการเกิดปฏิกิริยาของเอนไซม์ขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของสารตั้งต้นอย่างไร:

$v = \frac{V_{max} \times [S]}{K_m + [S]}$

• $v$ = อัตราเร็วของปฏิกิริยา ซึ่งเป็นอัตราที่ความเข้มข้นของสารตั้งต้นค่าหนึ่ง
• $V_{max}$ = อัตราเร็วสูงสุด ซึ่งเป็นอัตราเมื่อเอนไซม์อิ่มตัวด้วยสารตั้งต้นอย่างเต็มที่
• $[S]$ = ความเข้มข้นของสารตั้งต้น
• $K_m$ = ค่าคงที่ไมเคิลิส ซึ่งเป็นความเข้มข้นของสารตั้งต้นที่อัตราเร็วเท่ากับครึ่งหนึ่งของ Vmax

สูตรกิจกรรมจำเพาะ

กิจกรรมจำเพาะคำนวณโดยนำอัตราเร็วดังกล่าวหารด้วยปริมาณโปรตีนเอนไซม์ที่มีอยู่ ได้ผลลัพธ์เป็นหน่วยต่อมิลลิกรัม (U/mg):

$A = \frac{v}{[E]} = \frac{V_{max} \times [S]}{(K_m + [S]) \times [E]}$

ในที่นี้ $A$ คือกิจกรรมจำเพาะ และ $[E]$ คือความเข้มข้นของเอนไซม์

หน่วยเอนไซม์หนึ่งหน่วย (U) คือปริมาณเอนไซม์ที่เปลี่ยนสารตั้งต้น 1 ไมโครโมล (µmol) ต่อนาที คำนิยามนี้กำหนดโดยสหภาพชีวเคมีและชีววิทยาโมเลกุลระหว่างประเทศ (IUBMB)

หน่วยมีความสัมพันธ์กันดังนี้ ในสมการไมเคิลิส–เมนเทน อัตราเร็วมีหน่วยเป็นความเข้มข้นของสารตั้งต้นหารด้วยเวลา เครื่องคำนวณใช้ [S] และ Km ในหน่วย mM ดังนั้น Vmax และ v จึงมีหน่วยเป็น µmol ต่อนาทีต่อมิลลิลิตร เขียนเป็น µmol/(min·mL) ซึ่งเท่ากับ mM/min และเท่ากับ U/mL เช่นกัน ความเข้มข้นของเอนไซม์ [E] มีหน่วยเป็น mg/mL เมื่อหารกันแล้วหน่วยมิลลิลิตรจะตัดกัน:

$\frac{\text{µmol}/(\text{min}\cdot\text{mL})}{\text{mg}/\text{mL}} = \frac{\text{µmol}}{\text{min}\cdot\text{mg}} = \text{U/mg}$

Vmax มีหน่วย “ต่อนาที” อยู่แล้ว จึงไม่ต้องมีพจน์เวลาแยกต่างหากในสูตร

การคำนวณนี้สมมติว่าอัตราเร็วที่วัดได้เป็นอัตราเริ่มต้น ซึ่งวัดในช่วงต้นของปฏิกิริยา ก่อนที่สารตั้งต้นจะลดลงมากหรือผลิตภัณฑ์จะเริ่มยับยั้งเอนไซม์ โดยทั่วไปห้องปฏิบัติการจะวัดการเปลี่ยนสารตั้งต้นในช่วง 5–10% แรก เพื่อให้อยู่ในช่วงเชิงเส้นดังกล่าว

ตัวอย่างพร้อมวิธีทำ

ตัวอย่าง 1 ความเข้มข้นของเอนไซม์ 1 mg/mL ความเข้มข้นของสารตั้งต้น 10 mM ค่า Km 5 mM และ Vmax 50 µmol/(min·mL) ค่าเหล่านี้เป็นค่าเริ่มต้นของเครื่องคำนวณ

อัตราเร็ว = (50 × 10) / (5 + 10) = 500 / 15 = 33.33 µmol/(min·mL) กิจกรรมจำเพาะ = 33.33 / 1 = 33.33 U/mg

ตัวอย่าง 2 เงื่อนไขเดียวกัน แต่เพิ่มความเข้มข้นของเอนไซม์เป็นสองเท่า คือ 2 mg/mL

อัตราเร็ว = 33.33 µmol/(min·mL) ไม่เปลี่ยนแปลง เนื่องจากอัตราเร็วไม่ขึ้นอยู่กับ [E] ในสมการนี้ กิจกรรมจำเพาะ = 33.33 / 2 = 16.67 U/mg

การเพิ่มปริมาณเอนไซม์เป็นสองเท่าทำให้กิจกรรมจำเพาะลดลงครึ่งหนึ่ง เพราะขณะนี้อัตราเร็วรวมเท่าเดิมถูกหารด้วยปริมาณโปรตีนที่เพิ่มขึ้นเป็นสองเท่า

ตัวอย่าง 3 เพิ่มสารตั้งต้นเป็น 100 mM ซึ่งสูงกว่า Km มาก โดยมีความเข้มข้นของเอนไซม์ 1 mg/mL ค่า Km 5 mM และ Vmax 50 µmol/(min·mL)

อัตราเร็ว = (50 × 100) / (5 + 100) = 5000 / 105 = 47.62 µmol/(min·mL) กิจกรรมจำเพาะ = 47.62 / 1 = 47.62 U/mg

เมื่อความเข้มข้นของสารตั้งต้นสูง เอนไซม์จะเกือบอิ่มตัว ดังนั้นอัตราเร็วจึงใกล้เคียงกับ Vmax

ตัวอย่าง 4 ลดสารตั้งต้นเป็น 1 mM ซึ่งต่ำกว่า Km โดยมีความเข้มข้นของเอนไซม์ 1 mg/mL ค่า Km 5 mM และ Vmax 50 µmol/(min·mL)

อัตราเร็ว = (50 × 1) / (5 + 1) = 50 / 6 = 8.33 µmol/(min·mL) กิจกรรมจำเพาะ = 8.33 / 1 = 8.33 U/mg

เมื่อค่าต่ำกว่า Km ปริมาณสารตั้งต้นที่น้อยจะเป็นตัวจำกัดปฏิกิริยา ดังนั้นทั้งอัตราเร็วและกิจกรรมจำเพาะจึงต่ำกว่า Vmax มาก

อธิบายพารามิเตอร์สำคัญ

ความเข้มข้นของเอนไซม์ [E] คือมวลโปรตีนเอนไซม์ต่อปริมาตร มีหน่วยเป็น mg/mL ค่าที่สูงขึ้นหมายถึงอัตราเร็วของปฏิกิริยาเท่าเดิมถูกกระจายไปในโปรตีนปริมาณมากขึ้น ทำให้กิจกรรมจำเพาะลดลง กิจกรรมจำเพาะ ไม่ใช่ความเข้มข้นโดยตรง เป็นค่าที่แสดงว่าเอนไซม์ที่เตรียมไว้ทำงานได้ดีเพียงใด

ความเข้มข้นของสารตั้งต้น [S] คือปริมาณสารตั้งต้นที่เอนไซม์ใช้ทำปฏิกิริยา โดยทั่วไปมีหน่วยเป็น mM เมื่อ [S] ต่ำ การเพิ่มเพียงเล็กน้อยจะทำให้อัตราเร็วเพิ่มขึ้นอย่างมาก แต่เมื่อใกล้อิ่มตัว สารตั้งต้นที่เพิ่มขึ้นแทบไม่ช่วยเพิ่มอัตราเร็ว

ค่าคงที่ไมเคิลิส (Km) คือความเข้มข้นของสารตั้งต้นที่อัตราเร็วเท่ากับครึ่งหนึ่งของ Vmax ค่า Km ต่ำหมายความว่าเอนไซม์มีอัตราเร็วถึงครึ่งหนึ่งของอัตราสูงสุดได้ที่ความเข้มข้นของสารตั้งต้นต่ำ ซึ่งบ่งชี้ว่าเอนไซม์จับกับสารตั้งต้นได้แน่น ตัวอย่างเช่น เฮกโซไคเนสมีค่า Km ของกลูโคสใกล้เคียง 0.1 mM แสดงว่ามีสัมพรรคภาพสูง

อัตราเร็วสูงสุด (Vmax) คืออัตราเมื่อสารตั้งต้นไม่ใช่ปัจจัยจำกัด ให้ป้อนค่าเป็น µmol/(min·mL) ซึ่งเท่ากับ mM/min หรือ U/mL เพื่อให้สอดคล้องกับหน่วย mM ของ [S] และ Km ค่านี้ขึ้นอยู่กับปริมาณเอนไซม์ที่มีอยู่และความเร็วที่โมเลกุลเอนไซม์แต่ละโมเลกุลเปลี่ยนสารตั้งต้น (จำนวนการหมุนเวียนของเอนไซม์ หรือ kcat)

เวลาที่เกิดปฏิกิริยา คือระยะเวลาที่การทดสอบดำเนินไป ค่านี้ช่วยในการวางแผนการทดลอง เพราะหากปล่อยปฏิกิริยาไว้นานเกินไป สารตั้งต้นอาจหมดและปฏิกิริยาอาจไม่เป็นเชิงเส้นอีกต่อไป แต่เวลานี้ไม่ใช่ส่วนหนึ่งของสูตรกิจกรรมจำเพาะ

การอ่านกราฟอัตราเร็ว

กราฟแสดงอัตราเร็วเทียบกับความเข้มข้นของสารตั้งต้นโดยใช้สมการไมเคิลิส–เมนเทน

• ต่ำกว่า Km: อัตราเร็วเพิ่มขึ้นโดยประมาณตามสัดส่วนของสารตั้งต้น ความคลาดเคลื่อนเล็กน้อยของความเข้มข้นสารตั้งต้นทำให้ผลลัพธ์คลาดเคลื่อนได้มาก
• ใกล้ Km: เส้นโค้งเริ่มโค้งงอ อัตราเร็วเท่ากับครึ่งหนึ่งของ Vmax
• สูงกว่า Km: เส้นโค้งราบลง สารตั้งต้นที่เพิ่มขึ้นทำให้อัตราเร็วเพิ่มเพียงเล็กน้อย เพราะเอนไซม์เกือบอิ่มตัว

เหตุใดกิจกรรมจำเพาะจึงสำคัญ

กิจกรรมจำเพาะเป็นค่ามาตรฐานที่ใช้วัดความบริสุทธิ์และคุณภาพของเอนไซม์ ระหว่างการทำให้บริสุทธิ์ นักวิทยาศาสตร์จะติดตามค่านี้ในแต่ละขั้นตอน สารสกัดเซลล์หยาบอาจมีค่าเพียงไม่กี่ U/mg ขณะที่ตัวอย่างที่บริสุทธิ์มากอาจมีค่าถึงหลายร้อยหรือหลายพัน U/mg กิจกรรมจำเพาะที่เพิ่มขึ้นตลอดกระบวนการทำให้บริสุทธิ์แสดงว่าโปรตีนที่ไม่ทำงานถูกกำจัดออก ขณะที่เอนไซม์ที่ต้องการยังคงอยู่

การวัดแบบเดียวกันนี้สนับสนุนการค้นคว้ายา โดยนักวิจัยทดสอบว่าสารประกอบที่เป็นตัวเลือกทำให้กิจกรรมของเอนไซม์ลดลงอย่างไร และสนับสนุนการวินิจฉัยทางคลินิก โดยแพทย์วัดเอนไซม์ เช่น ALT และ AST ในเลือดเพื่อตรวจหาความเสียหายของตับ

คำถามที่พบบ่อย

คำนวณกิจกรรมของเอนไซม์จาก Km และ Vmax อย่างไร ขั้นแรกหาอัตราเร็วของปฏิกิริยาด้วยสมการไมเคิลิส–เมนเทน v = (Vmax × [S]) / (Km + [S]) จากนั้นหารด้วยความเข้มข้นของเอนไซม์เพื่อหากิจกรรมจำเพาะในหน่วย U/mg: Activity = v / [E] ให้ Vmax มีหน่วยเป็น µmol/(min·mL) และ [E] มีหน่วยเป็น mg/mL เพื่อให้หน่วยตัดกันเหลือเป็น U/mg

หน่วย (U) ของกิจกรรมเอนไซม์คืออะไร หนึ่งหน่วยคือปริมาณเอนไซม์ที่เปลี่ยนสารตั้งต้น 1 µmol ต่อนาทีภายใต้เงื่อนไขที่กำหนด ตามคำนิยามของ IUBMB

เหตุใดสูตรจึงไม่รวมเวลาที่เกิดปฏิกิริยา Vmax แสดงเป็นปริมาณต่อนาทีอยู่แล้ว จึงเป็นอัตรา ไม่ใช่ปริมาณรวม การหารด้วยเวลาอีกครั้งจะเป็นการนับเวลาซ้ำ และทำให้ผลลัพธ์ขึ้นอยู่กับระยะเวลาที่การทดสอบดำเนินไป ซึ่งไม่ควรเกิดขึ้นกับคุณสมบัติของตัวเอนไซม์เอง

เหตุใดกิจกรรมจำเพาะจึงลดลงเมื่อความเข้มข้นของเอนไซม์เพิ่มขึ้น อัตราเร็วในสมการไมเคิลิส–เมนเทนไม่ได้ขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของเอนไซม์ กิจกรรมจำเพาะนำอัตราเร็วคงที่นั้นไปหารด้วย [E] ดังนั้นเมื่อ [E] มากขึ้น ผลลัพธ์จึงเล็กลง การเปรียบเทียบกิจกรรมจำเพาะ ไม่ใช่อัตราเร็วโดยตรง เป็นวิธีเปรียบเทียบสารละลายเอนไซม์ที่มีความเข้มข้นต่างกันอย่างเป็นธรรม

Km ต่ำหมายความว่าอย่างไร Km ต่ำหมายความว่าเอนไซม์มีอัตราเร็วถึงครึ่งหนึ่งของอัตราสูงสุดได้ที่ความเข้มข้นของสารตั้งต้นต่ำ แสดงว่าเอนไซม์กับสารตั้งต้นจับกันได้แน่น

กิจกรรมจำเพาะมีค่าเป็นลบได้หรือไม่ ไม่ได้ ผลลัพธ์ที่เป็นลบบ่งชี้ว่าป้อนข้อมูลผิด เช่น ความเข้มข้นติดลบ หรือคำนวณผิด ไม่ใช่ค่าที่วัดได้จริงของเอนไซม์

เอกสารอ้างอิง

1. Michaelis, L., & Menten, M. L. (1913). Die Kinetik der Invertinwirkung. Biochemische Zeitschrift, 49, 333-369.
2. Berg, J. M., Tymoczko, J. L., & Stryer, L. (2012). Biochemistry (ฉบับที่ 7). W.H. Freeman and Company.
3. สหภาพชีวเคมีและชีววิทยาโมเลกุลระหว่างประเทศ (IUBMB). การตั้งชื่อเอนไซม์ https://iubmb.qmul.ac.uk/
4. ฐานข้อมูลเอนไซม์ BRENDA https://www.brenda-enzymes.org/