เครื่องคำนวณประสิทธิภาพ qPCR: เครื่องมือวิเคราะห์กราฟมาตรฐาน

เครื่องคำนวณประสิทธิภาพ qPCR

เครื่องคำนวณประสิทธิภาพ qPCR ใช้ประมาณว่าปฏิกิริยาพีซีอาร์เชิงปริมาณ (qPCR) คัดลอกลำดับดีเอ็นเอเป้าหมายได้ดีเพียงใดในแต่ละรอบการเพิ่มจำนวน โดยใช้ค่า Ct (หมายเลขรอบที่สัญญาณเรืองแสงข้ามค่าขีดจำกัดที่กำหนด) จากชุดการเจือจาง เพื่อคำนวณประสิทธิภาพ ความชัน จุดตัดแกน และ R²

ประสิทธิภาพ qPCR คืออะไร?

พีซีอาร์เชิงปริมาณติดตามการเรืองแสงขณะที่ปฏิกิริยาคัดลอกลำดับดีเอ็นเอเป้าหมายในแต่ละรอบ ประสิทธิภาพการเพิ่มจำนวนอธิบายว่าปริมาณดีเอ็นเอเป้าหมายเพิ่มขึ้นเท่าใดในแต่ละรอบ ที่ประสิทธิภาพ 100% ปริมาณดีเอ็นเอเป้าหมายจะเพิ่มเป็นสองเท่าในทุกรอบ

ในทางปฏิบัติ ปฏิกิริยามักไม่ให้ประสิทธิภาพเท่ากับ 100% พอดี ห้องปฏิบัติการส่วนใหญ่ถือว่าประสิทธิภาพระหว่าง 90% ถึง 110% อยู่ในระดับยอมรับได้สำหรับการหาปริมาณที่เชื่อถือได้ ค่าต่ำกว่า 90% หรือสูงกว่า 110% บ่งชี้ว่าอาจมีปัญหา เช่น การออกแบบไพรเมอร์ไม่ดี สารยับยั้ง PCR ที่ติดมาจากการสกัดตัวอย่าง หรือความผิดพลาดในการใช้ปิเปตระหว่างการเตรียมชุดการเจือจาง

ประสิทธิภาพมีความสำคัญมากที่สุดเมื่อเปรียบเทียบการแสดงออกของยีนระหว่างตัวอย่าง วิธี ΔΔCt ที่ใช้กันทั่วไปในการคำนวณการเปลี่ยนแปลงแบบเท่าตัวตั้งอยู่บนสมมติฐานว่าทุกปฏิกิริยามีประสิทธิภาพ 100% เมื่อประสิทธิภาพที่วัดได้แตกต่างจาก 100% หรือเมื่อยีนเป้าหมายกับยีนอ้างอิงมีประสิทธิภาพแตกต่างกัน ผลการเปลี่ยนแปลงแบบเท่าตัวอาจคลาดเคลื่อนได้

สูตรคำนวณประสิทธิภาพ qPCR

คำนวณประสิทธิภาพจากความชันของเส้นโค้งมาตรฐาน ซึ่งเป็นเส้นที่ได้จากการพล็อตค่า Ct เทียบกับลอการิทึมฐาน 10 (log10) ของปริมาณดีเอ็นเอตั้งต้นในชุดการเจือจาง

E = 10^(-1/ความชัน) - 1

E คือประสิทธิภาพ ซึ่งแสดงเป็นเลขทศนิยม (คูณด้วย 100 เพื่อแปลงเป็นเปอร์เซ็นต์) ความชันคือความชันของเส้นโค้งมาตรฐาน โดยมีค่าเป็นลบ เนื่องจากค่า Ct เพิ่มขึ้นเมื่อปริมาณดีเอ็นเอตั้งต้นลดลง

ความชัน -3.32 สอดคล้องกับประสิทธิภาพ 100%:

10^(-1/-3.32) - 1 = 10^0.301–1 ≈ 1.00

ผลลัพธ์เป็นเช่นนี้เพราะการเจือจางสิบเท่า 10 ควรทำให้ค่า Ct เลื่อนไปประมาณ 3.32 รอบ หากปฏิกิริยาทำให้ดีเอ็นเอเพิ่มเป็นสองเท่าในทุกรอบ เนื่องจาก log2(10) มีค่าประมาณ 3.32

ในทางปฏิบัติ ความชันระหว่าง -3.1 ถึง -3.6 ถือว่ายอมรับได้ ช่วงดังกล่าวสอดคล้องกับประสิทธิภาพประมาณ 90% ถึง 110% ความชันที่ใกล้ -3.1 มากกว่าจะให้ประสิทธิภาพที่คำนวณได้สูงกว่า ส่วนความชันที่ใกล้ -3.6 มากกว่าจะให้ค่าต่ำกว่า

วิธีคำนวณประสิทธิภาพ qPCR: วิธีเส้นโค้งมาตรฐาน

1. เตรียมชุดการเจือจาง เริ่มจากตัวอย่างที่มีความเข้มข้นสูงที่สุด แล้วเจือจางด้วยปัจจัยคงที่ ซึ่งโดยทั่วไปคือ 10 เท่า สำหรับตัวอย่างถัดไปแต่ละตัวอย่าง ทำ qPCR กับตัวอย่างเจือจางแต่ละระดับและบันทึกค่า Ct
2. แปลงการเจือจางแต่ละระดับเป็นค่า log10 โดยกำหนดให้ตัวอย่างแรกซึ่งมีความเข้มข้นสูงที่สุดอยู่ที่ตำแหน่ง 0 ตัวอย่างหมายเลข i จะมีค่า log10(ปริมาณสัมพัทธ์) เท่ากับ -i × log10(ปัจจัยการเจือจาง)
3. พล็อตค่า Ct (แกนตั้ง) เทียบกับค่า log10 (แกนนอน) สำหรับการเจือจางทุกระดับ แล้วทำการถดถอยเชิงเส้น
4. อ่านค่าความชัน จุดตัดแกน และ R² ของเส้นถดถอย
5. แทนค่าความชันใน E = 10^(-1/ความชัน) - 1 เพื่อหาประสิทธิภาพ

เกณฑ์คุณภาพของเส้นโค้งมาตรฐาน

• R² อย่างน้อย 0.98 ค่านี้วัดว่าจุดข้อมูลสอดคล้องกับเส้นตรงมากเพียงใด ค่าที่ต่ำกว่ามักบ่งชี้ถึงความผิดพลาดในการใช้ปิเปตหรือการเพิ่มจำนวนที่ไม่สม่ำเสมอ
• ความชันอยู่ระหว่าง -3.1 ถึง -3.6 ช่วงนี้สอดคล้องกับประสิทธิภาพ 90–110%
• มีจุดข้อมูลจากการเจือจางอย่างน้อยสามจุด การใช้ห้าหรือหกจุดให้เส้นที่น่าเชื่อถือมากกว่าและช่วยให้สังเกตค่าผิดปกติได้ง่ายขึ้น
• ตัวอย่างที่เข้มข้นที่สุดควรให้ค่า Ct ประมาณ 15-20 ส่วนตัวอย่างที่เจือจางที่สุดควรมีค่า Ct ต่ำกว่า 35 เนื่องจากค่าที่สูงกว่านั้นเข้าใกล้ขีดจำกัดการตรวจวัด

ตัวอย่างพร้อมวิธีทำ

ชุดการเจือจางห้าระดับแบบ 10 เท่าให้ค่า Ct ต่อไปนี้ โดยเรียงจากเข้มข้นที่สุดไปน้อยที่สุด: 15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0

ค่า log10(ปริมาณสัมพัทธ์) คือ 0, -1, -2, -3, -4 เนื่องจากการเจือจางแต่ละขั้นเพิ่มค่า -log10(10) หรือ -1 ค่า Ct เพิ่มขึ้น 3.5 รอบในแต่ละขั้น ดังนั้นจุดข้อมูลจึงอยู่บนเส้นตรง และการถดถอยเชิงเส้นให้ผลดังนี้:

• ความชัน: -3.5
• จุดตัดแกน: 15.0
• R²: 1.0

ประสิทธิภาพ: E = 10^(-1/-3.5) - 1 = 10^0.286–1 ≈ 0.931 หรือประมาณ 93%

ประสิทธิภาพ 93% และ R² = 1.0 เป็นไปตามเกณฑ์คุณภาพมาตรฐาน และเหมาะสำหรับการหาปริมาณการแสดงออกของยีน

ตัวอย่างโค้ด

ฟังก์ชัน JavaScript นี้ใช้วิธีเดียวกับเครื่องคำนวณ โดยทำให้ดัชนีของค่า Ct แต่ละค่ามีเครื่องหมายตรงข้ามก่อนนำไปหาลอการิทึม เนื่องจากตัวอย่างแรกซึ่งเข้มข้นที่สุดมีปริมาณสัมพัทธ์สูงสุด และตัวอย่างถัดไปแต่ละตัวอย่างจะเจือจางมากขึ้น

1function qpcrEfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
2  // Sample 0 is most concentrated; each later sample is diluted further,
3  // so its log10(relative quantity) is negative.
4  const x = ctValues.map((_, i) => -i * Math.log10(dilutionFactor));
5  const n = ctValues.length;
6  let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0;
7  for (let i = 0; i < n; i++) {
8    sumX += x[i];
9    sumY += ctValues[i];
10    sumXY += x[i] * ctValues[i];
11    sumXX += x[i] * x[i];
12  }
13  const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
14  const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
15  const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
16  return { efficiency, slope, intercept };
17}
18
19qpcrEfficiency([15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0], 10);
20// => { efficiency: 93.07, slope: -3.5, intercept: 15 }
21

เหตุใดประสิทธิภาพจึงมีความสำคัญต่อการแสดงออกของยีน

การคำนวณการเปลี่ยนแปลงแบบเท่าตัว รวมถึงวิธี ΔΔCt ตั้งอยู่บนสมมติฐานว่าทุกปฏิกิริยาทำให้สารเป้าหมายเพิ่มเป็นสองเท่าในแต่ละรอบ เมื่อยีนเป้าหมายกับยีนอ้างอิงมีประสิทธิภาพที่วัดได้แตกต่างกัน สูตร ΔΔCt แบบพื้นฐานจะทำให้เกิดความคลาดเคลื่อน นักวิจัยมักเปลี่ยนไปใช้การคำนวณที่แก้ไขตามประสิทธิภาพ เช่น วิธีที่ Michael Pfaffl อธิบายไว้ใน 2001 เมื่อประสิทธิภาพแตกต่างกันมากกว่าประมาณห้าจุดเปอร์เซ็นต์ แนวทาง MIQE ซึ่งเป็นชุดมาตรฐานการรายงานผลที่มีการอ้างอิงอย่างแพร่หลายสำหรับ qPCR และเผยแพร่ใน 2009 แนะนำให้รายงานประสิทธิภาพที่คำนวณได้ ความชัน และ R² ควบคู่กับผลการหาปริมาณ

คำถามที่พบบ่อย

ประสิทธิภาพ qPCR ที่ดีควรมีค่าเปอร์เซ็นต์เท่าใด?

โดยทั่วไปยอมรับค่าระหว่าง 90% ถึง 110% โดยการทดสอบที่ปรับให้เหมาะสมดีมักอยู่ราว 95–105% ความชัน -3.32 สอดคล้องกับประสิทธิภาพ 100% พอดี

เหตุใดประสิทธิภาพ qPCR ของฉันจึงสูงกว่า 110%?

สาเหตุที่พบบ่อย ได้แก่ ความผิดพลาดในการใช้ปิเปตระหว่างการเตรียมชุดการเจือจาง การเกิดไพรเมอร์ไดเมอร์ สารยับยั้งที่ส่งผลต่อตัวอย่างเข้มข้นและตัวอย่างเจือจางไม่เท่ากัน หรือการกำหนดค่าขีดจำกัดการเรืองแสงไว้นอกระยะเอ็กซ์โพเนนเชียลของการเพิ่มจำนวน เส้นโค้งการหลอมที่มีมากกว่าหนึ่งยอดอาจบ่งชี้ถึงการเกิดไพรเมอร์ไดเมอร์

เหตุใดประสิทธิภาพ qPCR ของฉันจึงต่ำกว่า 90%?

สาเหตุที่เป็นไปได้ ได้แก่ การออกแบบไพรเมอร์ไม่ดี สารยับยั้ง PCR ที่ติดมาจากการสกัดตัวอย่าง หรืออุณหภูมิการจับคู่ที่ไม่เหมาะสม การตรวจสอบความจำเพาะของไพรเมอร์และการทำการไล่ระดับอุณหภูมิอาจช่วยค้นหาสาเหตุได้

ค่า R² ต่ำหมายความว่าอย่างไร?

R² วัดว่าค่า Ct สอดคล้องกับเส้นตรงเมื่อเทียบกับปริมาณในรูป log ได้ดีเพียงใด ค่าต่ำกว่า 0.98 บ่งชี้ว่าอาจมีความไม่สม่ำเสมอในการใช้ปิเปต ตัวอย่างถูกยับยั้ง หรือมีจุดการเจือจางที่อยู่ใกล้ขีดจำกัดการตรวจวัด

เส้นโค้งมาตรฐานต้องมีจุดการเจือจางกี่จุด?

อย่างน้อยสามจุด ซึ่งเป็นจำนวนขั้นต่ำที่จำเป็นสำหรับการถดถอยเชิงเส้น การใช้ห้าหรือหกจุดให้ค่าความชันที่น่าเชื่อถือมากกว่าและช่วยให้สังเกตค่าผิดปกติได้ง่ายขึ้น

ประสิทธิภาพเปลี่ยนแปลงระหว่างการทดลองได้หรือไม่?

ได้ ล็อตสารรีเอเจนต์ใหม่ ชุดไพรเมอร์ชุดใหม่ ชนิดตัวอย่างที่แตกต่างกัน หรือเครื่อง qPCR คนละเครื่อง อาจทำให้ประสิทธิภาพเปลี่ยนแปลงได้ ห้องปฏิบัติการหลายแห่งตรวจสอบประสิทธิภาพซ้ำทุกไม่กี่เดือนหรือเมื่อมีล็อตสารรีเอเจนต์ใหม่

เอกสารอ้างอิง

1. Bustin SA, Benes V, Garson JA และคณะ แนวทาง MIQE: ข้อมูลขั้นต่ำสำหรับการตีพิมพ์ผลการทดลอง quantitative real-time PCR Clinical Chemistry. 2009;55(4):611-622
2. Pfaffl MW แบบจำลองทางคณิตศาสตร์ใหม่สำหรับการหาปริมาณสัมพัทธ์ใน real-time RT-PCR Nucleic Acids Research. 2001;29(9):e45
3. Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. ค่าประมาณประสิทธิภาพ PCR ดีเพียงใด: ข้อเสนอแนะสำหรับการประเมินประสิทธิภาพ qPCR ที่แม่นยำและเชื่อถือได้ Biomolecular Detection and Quantification. 2015;3:9-16