Калькулятор температури гібридизації ДНК | Безкоштовний інструмент для ПЛР Tm

Що таке калькулятор температури відпалу ДНК?

Калькулятор температури відпалу ДНК оцінює температуру плавлення (Tm) праймера ДНК за його послідовністю. Tm — це температура, за якої половина молекул праймера зв’язана з цільовим ланцюгом, а половина — ні. У полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР) це значення визначає температуру, за якої праймери приєднуються до матриці ДНК.

Чому температура відпалу важлива в ПЛР

ПЛР копіює цільову ділянку ДНК через повторювані цикли нагрівання й охолодження. Кожен цикл має три етапи. Спочатку нагрівання розділяє дволанцюгову матрицю приблизно за температури 95 °C. Цей етап називається денатурацією. Потім реакційну суміш охолоджують до температури відпалу, зазвичай від 50 °C до 65 °C, щоб короткі праймери могли зв’язатися з комплементарними послідовностями на одноланцюгових ділянках. На третьому етапі температура підвищується приблизно до 72 °C, і фермент, який називається ДНК-полімеразою, подовжує праймери, утворюючи нові ланцюги ДНК.

Якщо температура відпалу надто низька, праймери зв’язуються з послідовностями, які збігаються лише частково, унаслідок чого утворюються додаткові небажані фрагменти ДНК. Якщо вона надто висока, праймери не можуть сформувати стабільний зв’язок із матрицею, і копіюється мало ДНК або вона не копіюється взагалі. Температура відпалу — один із перших параметрів, які дослідники змінюють, коли реакція ПЛР не дає результату.

Як вміст GC впливає на Tm

Праймер спаровується з цільовою послідовністю за допомогою водневих зв’язків. Пара гуанін—цитозин (G-C) утворює три водневі зв’язки. Пара аденін—тимін (A-T) утворює два. Праймер із більшою кількістю основ G і C потребує більшого нагрівання для розділення, тому має вищу Tm, ніж праймер такої самої довжини з більшою кількістю основ A і T. Вміст GC зазвичай записують у відсотках: кількість основ G і C ділять на загальну довжину послідовності та множать на 100.

Формула температури відпалу ДНК

Цей калькулятор застосовує одну з двох формул, яку обирають за довжиною праймера.

Для праймерів із 14 нуклеотидів або довших він використовує формулу вмісту GC Мармура—Доті:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

Тут N_GC — кількість основ G і C у праймері, яку підраховують безпосередньо, а не у відсотках. N — загальна кількість основ.

Для праймерів, коротших за 14 нуклеотидів, він використовує правило Воллеса:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A, T, G і C позначають кількість відповідної основи в праймері.

Обидві формули передбачають типові умови ПЛР: приблизно 50 наномоль праймера та 50 мілімоль Na+.

Приклад обчислення

Розглянемо праймер із 19 основ ATGCTAGCTAGCTGCTAGC. Його довжина становить 19, тобто 14 або більше, тому калькулятор використовує формулу Мармура—Доті.

• Довжина (N) = 19
• Кількість G = 5, кількість C = 5, тому N_GC = 10, а вміст GC становить 10 / 19 × 100 ≈ 52,6%
• Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) / 19 = 64,9 + 41 × (−6,4) / 19 = 64,9 − 13,8 ≈ 51,1 °C

У формулі використовується кількість GC, 10, а не відсотковий вміст GC, 52,6. Помилкове використання відсоткового значення дає Tm близько 143 °C, що є нереалістичним значенням для реакції ПЛР, яка проходить за температури від 50 °C до 95 °C.

Як користуватися цим калькулятором

Введіть або вставте послідовність праймера, використовуючи лише літери A, T, G і C. Калькулятор показує довжину послідовності в нуклеотидах (nt), вміст GC у відсотках і розраховану температуру відпалу в градусах Цельсія. Результат можна скопіювати до лабораторних нотаток або протоколу.

Вибір температури відпалу для ПЛР

Tm — це розрахункова оцінка, а не гарантована робоча температура. У багатьох протоколах фактичний етап відпалу починають на кілька градусів нижче за розраховану Tm, а потім коригують температуру за результатом електрофорезу в гелі. Для пари праймерів за початкову точку зазвичай беруть нижче з двох значень Tm. Градієнтна ПЛР, під час якої одночасно проводять кілька реакцій у діапазоні температур, є поширеним способом знайти оптимальну температуру методом перевірки.

Інші способи оцінювання Tm

Використані тут формули Мармура—Доті та Воллеса є швидкими наближеннями, що ґрунтуються лише на складі основ. Існують і інші методи:

• Термодинаміка найближчих сусідів враховує вплив кожної пари сусідніх основ на стабільність і вважається точнішим методом для стандартних праймерів.
• Формули з поправкою на сіль додають корекцію на концентрацію іонів Na+ або K+ у реакційному буфері, оскільки вища концентрація солі стабілізує дуплекс ДНК і підвищує Tm.

Різні калькулятори можуть показувати різні значення Tm для того самого праймера, оскільки використовують різні формули. Проведення ПЛР і перевірка результату залишаються остаточним випробуванням.

Поширені запитання

Що таке температура відпалу ДНК?

Це температура, за якої праймери ДНК під час ПЛР зв’язуються з комплементарною послідовністю на матричному ланцюзі. У лабораторіях зазвичай встановлюють її на кілька градусів нижче за розраховану температуру плавлення праймера (Tm).

Як обчислюють Tm праймера?

Для праймерів із 14 основ або довших Tm = 64,9 + 41 × (кількість GC − 16,4) / довжина. Для праймерів, коротших за 14 основ, Tm = 2 × (кількість A+T) + 4 × (кількість G+C).

Чому вміст GC підвищує Tm?

Пари основ G-C утворюють три водневі зв’язки, тоді як пари A-T — два. Праймер із більшою часткою основ G і C потребує більше енергії, а отже, вищої температури, щоб відокремитися від цільової послідовності.

Чи має температура відпалу для ПЛР дорівнювати розрахованій Tm?

Ні. Більшість протоколів починають із температури на кілька градусів нижчої за розраховану Tm, а потім коригують її, оскільки Tm відповідає точці, у якій зв’язана лише половина праймера.

Чи змінює довжина праймера Tm?

Так, хоча й не простим способом. Довжина стоїть у знаменнику формули Мармура—Доті, тому довший праймер із середнім вмістом GC не обов’язково має вищу Tm, ніж коротший праймер із високим вмістом GC.

Чому різні калькулятори Tm дають різні результати?

Вони використовують різні формули. Правило Воллеса, формула вмісту GC Мармура—Доті, термодинаміка найближчих сусідів і формули з поправкою на сіль можуть давати різні значення Tm для того самого праймера, іноді з різницею в кілька градусів.

Джерела

1. Marmur J, Doty P. Визначення складу основ дезоксирибонуклеїнової кислоти за температурою її термічної денатурації. J Mol Biol. 1962;5(1):109-118.
2. Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. Гібридизація синтетичних олігодезоксирибонуклеотидів із ДНК phi chi 174. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557.
3. SantaLucia J Jr. Єдиний підхід до термодинаміки найближчих сусідів полімерної, дволанцюгової та олігонуклеотидної ДНК. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465.