Калькулятор копійності ДНК | Інструмент геномного аналізу

Калькулятор кількості копій ДНК

Калькулятор кількості копій ДНК оцінює, скільки копій цільової послідовності міститься у зразку ДНК. Він використовує концентрацію зразка, його об’єм і частоту появи цільової послідовності всередині довшої послідовності ДНК. Лабораторії молекулярної біології застосовують таку оцінку для планування експериментів, наприклад кПЛР (кількісної полімеразної ланцюгової реакції), перед проведенням дорожчого й точнішого аналізу.

Що означає кількість копій ДНК

Кількість копій ДНК — це число появ конкретної послідовності в геномі або зразку. Типовий ген людини представлений двома копіями: одна успадкована від кожного з батьків. Цю кількість можуть змінювати кілька чинників.

• Ампліфікація: більше двох копій. У ракових клітинах часто ампліфікуються гени, що стимулюють ріст, наприклад HER2 у деяких пухлинах молочної залози.
• Делеція: менше двох копій, іноді жодної. Делеції можуть спричиняти генетичні розлади.
• Дуплікація: з’являється додаткова копія там, де мала бути одна або дві.
• Варіація кількості копій (CNV): нормальна різниця в кількості копій між людьми, яка спостерігається у значній частині геному людини.

Формула кількості копій ДНК

Калькулятор перетворює кількість появ послідовності й масу зразка на кількість копій за цією формулою:

$\text{Кількість копій} = \frac{\text{Кількість появ} \times \text{Концентрація} \times \text{Об’єм} \times N_A}{\text{Довжина ДНК} \times 660 \times 10^{9}}$

де:

• Кількість входжень — скільки разів цільова послідовність з’являється у повній послідовності ДНК; перекривні збіги рахують окремо.
• Концентрація — концентрація ДНК у нанограмах на мікролітр (нг/мкл), яку зазвичай визначають за допомогою спектрофотометра або флуориметра.
• Об’єм — об’єм зразка в мікролітрах (мкл).
• $N_A$ — число Авогадро, 6,022 × 10²³ молекул на моль. Воно перетворює кількість речовини ДНК у молях на кількість молекул.
• Довжина ДНК — довжина повної послідовності ДНК у парах основ.
• 660 — середня молекулярна маса однієї пари основ ДНК у грамах на моль (г/моль). Пара основ складається з двох комплементарно спарених нуклеотидів — по одному з кожного ланцюга ДНК.
• 10⁹ — коефіцієнт перетворення нанограмів у грами.

Спочатку формула перетворює масу зразка на кількість речовини молекул ДНК у молях, потім множить її на число Авогадро, щоб отримати загальну кількість молекул ДНК у зразку, а далі — на кількість появ цільової послідовності в кожній молекулі.

Інструмент приймає лише літери A, T, C і G. Пробіли та переноси рядків ігноруються, а малі літери рахуються так само, як великі.

Як розрахувати кількість копій ДНК: приклад із розв’язанням

Візьмімо послідовність ДНК завдовжки 12 пар основ — ATCGATCGATCG — із цільовою послідовністю ATCG, концентрацією 10 нг/мкл і об’ємом 20 мкл.

Крок 1: підрахунок входжень. ATCG з’являється 3 рази в ATCGATCGATCG — у позиціях 1, 5 і 9.

Крок 2: визначення загальної маси ДНК. Концентрація × об’єм = 10 × 20 = 200 нг.

Крок 3: перетворення на кількість речовини. 200 нг = 2 × 10⁻⁷ г. Ділення на (12 пар основ × 660 г/моль) = 7 920 г/моль дає 2,53 × 10⁻¹¹ mol.

Крок 4: перетворення на кількість молекул. Помножимо на число Авогадро: 2,53 × 10⁻¹¹ mol × 6,022 × 10²³ молекул/моль ≈ 1,52 × 10¹³ молекул ДНК.

Крок 5: множення на кількість появ. 3 × 1,52 × 10¹³ ≈ 4,56 × 10¹³, або приблизно 45 621 212 121 212 копій.

Це число здається величезним, оскільки зразок об’ємом 20 мкл і концентрацією 10 нг/мкл усе одно містить трильйони коротких молекул ДНК. У реальних зразках зазвичай використовують набагато довші послідовності, тому за тієї самої маси кількість молекул буде меншою.

Де застосовують аналіз кількості копій ДНК

Діагностика раку. Патологоанатомічні лабораторії визначають кількість копій HER2 у тканині пухлин молочної залози. Нормальна клітина має дві копії. В ампліфікованій пухлині їх може бути шість або більше, що впливає на можливість застосування таргетних препаратів, таких як трастузумаб.

Тестування на генетичні захворювання. Такі стани, як синдром Ді Джорджі, пов’язані з делецією сегмента хромосоми. Синдром Дауна пов’язаний із додатковою копією хромосоми 21 (трисомія 21). Підрахунок копій допомагає підтвердити ці діагнози.

Кількісне визначення трансгенів і плазмід. Дослідники перевіряють, скільки копій вставленого гена потрапило в клітину рослини, тварини або бактерії. Зазвичай бажаною є одна копія, оскільки кілька копій можуть спричинити пригнічення експресії гена клітиною.

Моніторинг патогенів і вірусного навантаження. Оцінки кількості копій показують, скільки вірусної або бактеріальної ДНК міститься у зразку; це використовують для моніторингу інфекцій і дослідження довкілля.

Інші методи вимірювання кількості копій

Цей калькулятор швидко оцінює кількість копій за даними про послідовність і концентрацію. Лабораторії, яким потрібна вища точність, зазвичай використовують один із таких методів:

• Кількісна ПЛР (кПЛР): ампліфікує та вимірює ДНК у реальному часі; за наявності якісної калібрувальної кривої точність становить приблизно 15–20%.
• Цифрова ПЛР (дПЛР): розподіляє зразок на тисячі малих реакцій для прямого підрахунку без потреби в калібрувальній кривій.
• Флуоресцентна гібридизація in situ (FISH): безпосередньо підраховує послідовності в клітинах або хромосомах під мікроскопом; це стандартний метод у багатьох лабораторіях онкологічної діагностики.
• Секвенування нового покоління (NGS): секвенує весь зразок і одночасно визначає кількість копій у різних ділянках геному.

Поширені запитання

Що таке кількість копій ДНК? Це кількість копій певної послідовності ДНК у геномі або зразку. Більшість генів людини представлені двома копіями — по одній від кожного з батьків. Додаткові або відсутні копії можуть впливати на здоров’я та ризик захворювань.

Наскільки точний цей калькулятор? Він дає теоретичну оцінку на основі введених даних, а не результат лабораторного вимірювання. Точність залежить від того, наскільки точно виміряно концентрацію і наскільки специфічною є цільова послідовність. Для результатів, що публікуються, точнішими є такі методи, як цифрова ПЛР.

Чи можна використовувати цей калькулятор для РНК? Ні. У РНК замість тиміну використовується урацил і міститься інший цукор, тому її молекулярна маса відрізняється від молекулярної маси ДНК. Середня молекулярна маса РНК становить приблизно 330 г/моль на нуклеотид, тоді як для пари основ ДНК — приблизно 660 г/моль. Застосування формули для ДНК до даних РНК дасть неправильний результат.

Чому перекривну послідовність рахують більше одного разу? Калькулятор рахує кожну позицію, у якій цільова послідовність збігається, навіть якщо збіги мають спільні літери. У ATATAT послідовність ATA збігається двічі — у позиціях 1 і 3, оскільки кожну початкову позицію перевіряють окремо.

Який діапазон концентрації ДНК є оптимальним? Концентрації 10–100 нг/мкл забезпечують найнадійніші показники на стандартних лабораторних приладах. За концентрації нижче 10 нг/мкл похибка вимірювання зростає, тому замість стандартного спектрофотометра рекомендують чутливіший метод, наприклад флуориметр.

Чи може цей калькулятор оцінити кількість копій плазміди? Так. Введіть повну послідовність плазміди як послідовність ДНК, а унікальну ділянку вставки — як цільову послідовність, а також виміряну концентрацію плазміди й об’єм зразка.