Калькулятор розведення клітин

Калькулятор розведення клітин визначає, скільки клітинної суспензії та розчинника потрібно змішати, щоб отримати задану концентрацію клітин у вибраному кінцевому об’ємі. Його використовують у культивуванні клітин, мікробіології та інших лабораторних процедурах, де перед використанням зразок потрібно довести до точної концентрації.

Що означає розведення клітин

Розведення клітинної суспензії не змінює кількість клітин у ній. Воно лише змінює об’єм рідини, у якому перебувають клітини, і таким чином знижує концентрацію. Суспензія, у якій нараховується 1 000 000 клітин на мілілітр (клітин/мл), після розведення все одно містить таку саму загальну кількість клітин. Просто ця кількість розподіляється в більшому об’ємі рідини.

У лабораторіях клітини розводять перед багатьма стандартними процедурами: перенесенням культури, що росте, у нові флакони, внесенням фіксованої кількості клітин у кожну лунку планшета, заморожуванням клітин для зберігання або підготовкою зразка для лічильника клітин чи проточного цитометра.

Формула розведення клітин

Розрахунок ґрунтується на одному правилі. Кількість клітин, узятих із вихідної суспензії, помножена на її концентрацію, має дорівнювати кількості клітин у кінцевому об’ємі, помноженій на цільову концентрацію:

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

C₁ — початкова концентрація (у вихідній суспензії), клітин/мл
V₁ — об’єм вихідної суспензії, який потрібно використати, мл
C₂ — цільова концентрація, клітин/мл
V₂ — потрібний загальний кінцевий об’єм, мл

Розв’язання відносно V₁ дає об’єм вихідної суспензії, який потрібно набрати піпеткою:

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁

Решта кінцевого об’єму припадає на розчинник, зазвичай поживне середовище для культивування клітин, фосфатно-сольовий буфер (PBS) або інший буфер:

Об’єм розчинника = V₂ − V₁

Цільова концентрація (C₂) не може бути вищою за концентрацію вихідної суспензії (C₁). Розведення лише знижує концентрацію. Щоб її підвищити, потрібно осадити клітини центрифугуванням і ресуспендувати їх у меншому об’ємі рідини.

Як розрахувати розведення клітин

Порахуйте клітини у вихідній суспензії за допомогою гемоцитометра або автоматичного лічильника клітин, щоб отримати C₁.
Визначте цільову концентрацію C₂, передбачену протоколом.
Визначте потрібний загальний кінцевий об’єм V₂.
Розрахуйте V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁.
Розрахуйте об’єм розчинника як V₂ − V₁.
Наберіть піпеткою V₁ вихідної суспензії в пробірку, потім додайте об’єм поживного середовища або буфера, що дорівнює об’єму розчинника.

Приклад обчислення

У вихідній суспензії нараховується 1 000 000 клітин/мл. Протокол передбачає 100 000 клітин/мл у кінцевому об’ємі 10 мл.

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ = (100 000 × 10) ÷ 1 000 000 = 1 000 000 ÷ 1 000 000 = 1 мл

Об’єм розчинника = V₂ − V₁ = 10 − 1 = 9 мл

Якщо взяти 1 мл вихідної суспензії та додати 9 мл поживного середовища, буде отримано 10 мл суспензії з концентрацією 100 000 клітин/мл.

Другий приклад

Для аналізу в планшеті на 96 лунок потрібно 10 000 клітин на лунку в 200 мікролітрах (μL) поживного середовища на лунку. Це відповідає цільовій концентрації 50 000 клітин/мл, оскільки 10 000 клітин, поділені на 0,2 мл, дорівнюють 50 000 клітин/мл. У вихідній суспензії нараховується 2 000 000 клітин/мл, а для заповнення планшета з певним запасом на втрати під час піпетування потрібно загалом 20 мл.

V₁ = (50 000 × 20) ÷ 2 000 000 = 1 000 000 ÷ 2 000 000 = 0,5 мл

Об’єм розчинника = 20 − 0,5 = 19,5 мл

Змішування 0,5 мл вихідної суспензії з 19,5 мл поживного середовища дає 20 мл суспензії з концентрацією 50 000 клітин/мл і розведенням 1 до 40.

Джерела похибок

Сама формула є точною. Похибки виникають через числа, підставлені в неї.

Похибка підрахунку. Неправильний підрахунок клітин безпосередньо призводить до неправильного розведення. Щоб зменшити цей ризик, слід порахувати клітини в усіх чотирьох кутових квадратах сітки гемоцитометра й усереднити результат.
Скупчення клітин. Скупчення клітин під мікроскопом виглядає як одна клітина, хоча насправді складається з кількох клітин, тому занижує видиму концентрацію.
Діапазон піпетки. Піпетка, яку використовують поза її номінальним діапазоном об’єму, дає неточні результати. Піпетка на 1000 мкл, налаштована на дозування 5 мкл, ненадійна; натомість слід використовувати піпетку меншого об’єму.
Плутанина з одиницями. Змішування клітин/мл із клітинами/мкл дає похибку, що в тисячу разів перевищує правильне значення або є в тисячу разів меншою за нього.
Мертві клітини. Звичайний підрахунок клітин включає мертві клітини, якщо не використовували барвник для визначення життєздатності, наприклад трипановий синій. Через це можна завищити кількість живих клітин, які фактично присутні.

Обмеження цього калькулятора

Калькулятор відхиляє числа, для яких неможливо отримати корисний результат:

Кожне значення має бути більшим за нуль.
Цільова концентрація не може бути вищою за початкову концентрацію.
Початкова концентрація має бути не більшою за 1 трильйон клітин/мл (1 × 10¹²).
Розрахований об’єм вихідної суспензії має бути не меншим за 0,001 мл, тобто 1 мікролітр. Менший об’єм неможливо точно набрати піпеткою, тому калькулятор запропонує ввести інші числа. Зазвичай цю проблему можна вирішити збільшенням загального об’єму.

Об’єми відображаються з точністю до двох десяткових знаків або до трьох, якщо об’єм вихідної суспензії менший за 0,01 мл, щоб малий об’єм ніколи не відображався як 0,00 мл.

Поширені запитання

Яка формула розведення клітин?

C₁ × V₁ = C₂ × V₂, де C₁ і C₂ — початкова та цільова концентрації, а V₁ і V₂ — об’єм, узятий із вихідної суспензії, та загальний кінцевий об’єм.

Чи може цільова концентрація бути вищою за початкову?

Ні. Розведення лише знижує концентрацію. Щоб досягти вищої концентрації, потрібно центрифугувати клітини й ресуспендувати їх у меншому об’ємі.

Яку рідину слід використовувати для розведення клітин?

Повне поживне середовище використовують, коли клітини мають залишатися життєздатними протягом кількох годин або днів, наприклад перед засіванням планшета. PBS або подібний буферний сольовий розчин підходить для короткочасного розведення — приблизно до 30 хвилин — перед подальшою обробкою клітин. Середовище без сироватки використовують, коли білки сироватки можуть вплинути на подальший аналіз.

Чи працює ця формула для бактерій або дріжджів?

Так. Формула C₁V₁ = C₂V₂ застосовна до будь-якої суспензії частинок, зокрема до бактерій, вимірюваних у колонієутворювальних одиницях на мілілітр (КУО/мл), дріжджів і вірусних частинок, вимірюваних у бляшкоутворювальних одиницях на мілілітр (БОУ/мл), за умови використання однакових одиниць по обидва боки рівняння.

Чи слід враховувати мертві клітини під час розведення?

Для засівання живої культури слід враховувати лише життєздатні клітини. Якщо життєздатність суспензії становить 80%, її життєздатна концентрація дорівнює 0,8 від загальної кількості клітин, і саме цю життєздатну концентрацію слід використовувати як C₁.

Як точно виконувати дуже великі розведення?

Великі розведення, наприклад 1 до 1000, зазвичай виконують серією менших етапів, які називають послідовними розведеннями. Три послідовні розведення 1 до 10 дають загальне розведення 1 до 1000, водночас кожен етап піпетування залишається в межах точного діапазону об’єму.

Калькулятор розведення клітин - точний інструмент для лабораторних розведень