DNA Hybridiseringstemperatur Beregner | Gratis PCR Tm Værktøj

Hvad er en beregner til annealingtemperatur for DNA?

En beregner til annealingtemperatur for DNA estimerer smeltetemperaturen (Tm) for en DNA-primer ud fra dens sekvens. Tm er den temperatur, hvor halvdelen af primermolekylerne er bundet til deres målstreng, og halvdelen ikke er. Ved en polymerasekædereaktion (PCR) bruges denne værdi til at fastlægge den temperatur, der får primerne til at binde sig til DNA-skabelonen.

Hvorfor annealingtemperaturen er vigtig ved PCR

PCR kopierer et målområde af DNA gennem gentagne opvarmnings- og afkølingscyklusser. Hver cyklus har tre trin. Først adskilles den dobbeltstrengede skabelon ved omkring 95 °C. Dette trin kaldes denaturering. Derefter afkøles reaktionen til annealingtemperaturen, normalt mellem 50 °C og 65 °C, så korte primere kan binde til komplementære sekvenser på enkeltstrengene. Til sidst stiger temperaturen til omkring 72 °C, og et enzym kaldet DNA-polymerase forlænger primerne og opbygger nye DNA-strenge.

Hvis annealingtemperaturen er for lav, binder primerne til sekvenser, der kun passer delvist, hvilket danner ekstra uønskede DNA-fragmenter. Hvis den er for høj, kan primerne ikke danne en stabil binding til skabelonen, og der kopieres kun lidt eller intet DNA. Annealingtemperaturen er en af de første indstillinger, forskere justerer, når en PCR-reaktion mislykkes.

Hvordan GC-indhold påvirker Tm

En primer parres med sit mål gennem hydrogenbindinger. Et guanin-cytosin-par (G-C) danner tre hydrogenbindinger. Et adenin-thymin-par (A-T) danner to. En primer med flere G- og C-baser kræver mere varme for at blive skilt ad og har derfor en højere Tm end en primer af samme længde med flere A- og T-baser. GC-indhold angives normalt som en procentdel: antallet af G- og C-baser divideret med den samlede sekvenslængde gange 100.

Formel for DNA-annealingtemperatur

Denne beregner anvender en af to formler, valgt ud fra primerens længde.

For primere på 14 nukleotider eller længere anvendes Marmur-Doty-formlen for GC-indhold:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

Her er N_GC antallet af G- og C-baser i primeren, talt direkte og ikke som en procentdel. N er det samlede antal baser.

For primere på under 14 nukleotider anvendes Wallace-reglen:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A, T, G og C angiver hver antallet af den pågældende base i primeren.

Begge formler forudsætter almindelige PCR-betingelser: omkring 50 nanomolar primer og 50 millimolar Na+.

Regneeksempel

Betragt primeren på 19 baser, ATGCTAGCTAGCTGCTAGC. Dens længde er 19, hvilket er 14 eller mere, så beregneren anvender Marmur-Doty-formlen.

• Længde (N) = 19
• G-antal = 5, C-antal = 5, så N_GC = 10, og GC-indholdet er 10 / 19 × 100 ≈ 52,6 %
• Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) / 19 = 64,9 + 41 × (−6,4) / 19 = 64,9 − 13,8 ≈ 51,1 °C

Formlen anvender GC-antallet, 10, ikke GC-procentdelen, 52,6. Hvis procentdelen bruges ved en fejl, fås en Tm på omkring 143 °C, hvilket ikke er en realistisk værdi for en PCR-reaktion, der kører mellem 50 °C og 95 °C.

Sådan bruger du denne beregner

Indtast eller indsæt en primersekvens, der kun bruger bogstaverne A, T, G og C. Beregneren viser sekvenslængden i nukleotider (nt), GC-indholdet som en procentdel og den beregnede annealingtemperatur i grader Celsius. Resultatet kan kopieres til laboratorienoter eller en protokol.

Valg af annealingtemperatur ved PCR

Tm er et beregnet estimat, ikke en garanteret arbejdstemperatur. Mange PCR-protokoller begynder det faktiske annealingtrin nogle få grader under den beregnede Tm og justerer derefter ud fra resultatet på en gel. For et primerpar anvendes normalt den laveste af de to primeres Tm-værdier som udgangspunkt. Gradient-PCR, hvor flere reaktioner køres samtidigt over et temperaturinterval, er en almindelig måde at finde den bedste temperatur ved afprøvning.

Andre måder at estimere Tm på

De Marmur-Doty- og Wallace-formler, der anvendes her, er hurtige tilnærmelser, som kun bygger på basesammensætningen. Der findes andre metoder:

• Termodynamik baseret på nærmeste naboer tager højde for, hvordan hvert par af nabobaser påvirker stabiliteten, og regnes for den mest nøjagtige metode til standardprimere.
• Saltjusterede formler tilføjer en korrektion for koncentrationen af Na+- eller K+-ioner i reaktionsbufferen, da en højere saltkoncentration stabiliserer DNA-dobbelthelixen og hæver Tm.

Forskellige beregnere kan angive forskellige Tm-værdier for den samme primer, fordi de anvender forskellige formler. Det er fortsat den endelige test at køre PCR-reaktionen og kontrollere resultatet.

Ofte stillede spørgsmål

Hvad er annealingtemperatur for DNA?

Det er den temperatur, hvor DNA-primere binder til deres komplementære sekvens på en skabelonstreng under PCR. Laboratorier indstiller den normalt nogle få grader under primerens beregnede smeltetemperatur (Tm).

Hvordan beregnes primerens Tm?

For primere på 14 baser eller længere er Tm = 64,9 + 41 × (GC-antal − 16,4) / længde. For primere på under 14 baser er Tm = 2 × (A+T-antal) + 4 × (G+C-antal).

Hvorfor hæver GC-indholdet Tm?

G-C-basepar danner tre hydrogenbindinger sammenlignet med to for A-T-par. En primer med en større andel G- og C-baser kræver mere energi og dermed en højere temperatur for at blive skilt fra sit mål.

Skal PCR-annealingtemperaturen være lig med den beregnede Tm?

Nej. De fleste protokoller begynder flere grader under den beregnede Tm og justerer derfra, fordi Tm angiver det punkt, hvor kun halvdelen af primeren er bundet.

Ændrer primerens længde Tm?

Ja, dog ikke på en enkel måde. Længden står i nævneren i Marmur-Doty-formlen, så en længere primer med et gennemsnitligt GC-indhold får ikke automatisk en højere Tm end en kortere primer, der er rig på GC.

Hvorfor er forskellige Tm-beregnere uenige?

De anvender forskellige formler. Wallace-reglen, Marmur-Doty-formlen for GC-indhold, termodynamik baseret på nærmeste naboer og saltjusterede formler kan hver give en forskellig Tm for den samme primer, nogle gange med flere graders forskel.

Referencer

1. Marmur J, Doty P. Bestemmelse af deoxyribonukleinsyres basesammensætning ud fra dens termiske denatureringstemperatur. J Mol Biol. 1962;5(1):109-118.
2. Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. Hybridisering af syntetiske oligodeoxyribonukleotider til phi chi 174-DNA. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557.
3. SantaLucia J Jr. Et samlet syn på termodynamikken for nærmeste naboer i polymer-, dumbbell- og oligonukleotid-DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465.