DNA-Hybridisierungstemperatur-Rechner | Kostenfreies PCR-Tm-Tool

Was ist ein Rechner für die DNA-Annealing-Temperatur?

Ein Rechner für die Annealing-Temperatur von DNA schätzt die Schmelztemperatur (Tm) eines DNA-Primers anhand seiner Sequenz. Tm ist die Temperatur, bei der die Hälfte der Primermoleküle an den Zielstrang gebunden ist und die andere Hälfte nicht. Bei einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) dient dieser Wert zur Festlegung der Temperatur, bei der Primer an die DNA-Matrize binden.

Warum die Annealing-Temperatur bei der PCR wichtig ist

Bei der PCR wird ein bestimmter DNA-Abschnitt durch wiederholte Heiz- und Abkühlzyklen vervielfältigt. Jeder Zyklus besteht aus drei Schritten. Zunächst trennt die Erwärmung den doppelsträngigen Matrizenstrang bei etwa 95 °C. Dieser Schritt wird Denaturierung genannt. Anschließend kühlt die Reaktion auf die Annealing-Temperatur ab, gewöhnlich auf einen Wert zwischen 50 °C und 65 °C, sodass kurze Primer an passende Sequenzen der Einzelstränge binden können. Im dritten Schritt steigt die Temperatur auf etwa 72 °C, und ein als DNA-Polymerase bezeichnetes Enzym verlängert die Primer, um neue DNA-Stränge aufzubauen.

Ist die Annealing-Temperatur zu niedrig, binden Primer an Sequenzen, die nur teilweise übereinstimmen, wodurch zusätzliche unerwünschte DNA-Fragmente entstehen. Ist sie zu hoch, können die Primer keine stabile Bindung mit der Matrize bilden, und es wird wenig oder gar keine DNA vervielfältigt. Die Annealing-Temperatur gehört zu den ersten Einstellungen, die Forschende anpassen, wenn eine PCR-Reaktion fehlschlägt.

Wie der GC-Gehalt Tm beeinflusst

Ein Primer paart sich über Wasserstoffbrücken mit seinem Ziel. Ein Guanin-Cytosin-Basenpaar (G-C) bildet drei Wasserstoffbrücken. Ein Adenin-Thymin-Basenpaar (A-T) bildet zwei. Ein Primer mit mehr G- und C-Basen benötigt mehr Wärme zum Trennen und hat daher ein höheres Tm als ein gleich langer Primer mit mehr A- und T-Basen. Der GC-Gehalt wird gewöhnlich als Prozentsatz angegeben: die Anzahl der G- und C-Basen geteilt durch die gesamte Sequenzlänge, multipliziert mit 100.

Formel für die Annealing-Temperatur von DNA

Dieser Rechner verwendet eine von zwei Formeln, abhängig von der Primerlänge.

Für Primer mit 14 Nukleotiden oder mehr verwendet er die GC-Gehalts-Formel nach Marmur und Doty:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

Dabei ist N_GC die Anzahl der G- und C-Basen im Primer, die direkt als Anzahl und nicht als Prozentsatz ermittelt wird. N ist die Gesamtzahl der Basen.

Für Primer mit weniger als 14 Nukleotiden verwendet er die Wallace-Regel:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A, T, G und C stehen jeweils für die Anzahl der jeweiligen Base im Primer.

Beide Formeln setzen übliche PCR-Bedingungen voraus: etwa 50 Nanomolar Primer und 50 Millimolar Na+.

Rechenbeispiel

Betrachten wir den 19-Basen-Primer ATGCTAGCTAGCTGCTAGC. Seine Länge beträgt 19 und liegt damit bei 14 oder mehr, sodass der Rechner die Formel nach Marmur und Doty verwendet.

• Länge (N) = 19
• G-Anzahl = 5, C-Anzahl = 5, daher ist N_GC = 10, und der GC-Gehalt beträgt 10 / 19 × 100 ≈ 52,6 %
• Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) / 19 = 64,9 + 41 × (−6,4) / 19 = 64,9 − 13,8 ≈ 51,1 °C

Die Formel verwendet die GC-Anzahl 10, nicht den GC-Prozentsatz 52,6. Wird versehentlich der Prozentsatz eingesetzt, ergibt sich ein Tm von etwa 143 °C. Das ist kein realistischer Wert für eine PCR-Reaktion, die zwischen 50 °C und 95 °C durchgeführt wird.

So verwenden Sie diesen Rechner

Geben Sie eine Primersequenz ein oder fügen Sie sie ein; verwenden Sie dabei ausschließlich die Buchstaben A, T, G und C. Der Rechner gibt die Sequenzlänge in Nukleotiden (nt), den GC-Gehalt in Prozent und die berechnete Annealing-Temperatur in Grad Celsius an. Das Ergebnis kann für Labornotizen oder ein Protokoll kopiert werden.

Auswahl einer PCR-Annealing-Temperatur

Tm ist eine berechnete Schätzung und keine garantierte Arbeitstemperatur. Viele PCR-Protokolle setzen den tatsächlichen Annealing-Schritt zunächst einige Grad unterhalb des berechneten Tm an und passen die Temperatur anhand des Ergebnisses im Gel an. Bei einem Primerpaar wird normalerweise der niedrigere Tm-Wert der beiden Primer als Ausgangspunkt verwendet. Eine Gradienten-PCR, bei der mehrere Reaktionen gleichzeitig über einen Temperaturbereich hinweg durchgeführt werden, ist eine gängige Methode, die optimale Temperatur durch Ausprobieren zu ermitteln.

Andere Verfahren zur Schätzung von Tm

Die hier verwendeten Formeln nach Marmur und Doty sowie die Wallace-Regel sind schnelle Näherungen, die nur auf der Basenzusammensetzung beruhen. Es gibt weitere Verfahren:

• Die Thermodynamik der nächsten Nachbarn berücksichtigt, wie jedes Paar benachbarter Basen die Stabilität beeinflusst, und gilt als genaueres Verfahren für Standardprimer.
• Salzgehaltskorrigierte Formeln enthalten eine Korrektur für die Konzentration von Na+- oder K+-Ionen im Reaktionspuffer, da eine höhere Salzkonzentration den DNA-Doppelstrang stabilisiert und Tm erhöht.

Verschiedene Rechner können für denselben Primer unterschiedliche Tm-Werte ausgeben, weil sie verschiedene Formeln verwenden. Die Durchführung der PCR und die Kontrolle des Ergebnisses bleiben der abschließende Test.

Häufig gestellte Fragen

Was ist die Annealing-Temperatur von DNA?

Sie ist die Temperatur, bei der DNA-Primer während der PCR an ihre passende Sequenz auf einem Matrizenstrang binden. In Laboren wird sie gewöhnlich einige Grad unter der berechneten Schmelztemperatur (Tm) des Primers eingestellt.

Wie wird das Tm eines Primers berechnet?

Für Primer mit 14 Basen oder mehr gilt: Tm = 64,9 + 41 × (GC-Zahl − 16,4) / Länge. Für Primer mit weniger als 14 Basen gilt: Tm = 2 × (Anzahl A+T) + 4 × (Anzahl G+C).

Warum erhöht der GC-Gehalt Tm?

G-C-Basenpaare bilden drei Wasserstoffbrücken, während A-T-Paare zwei bilden. Ein Primer mit einem höheren Anteil an G- und C-Basen benötigt mehr Energie und damit eine höhere Temperatur, um sich von seinem Ziel zu trennen.

Sollte die PCR-Annealing-Temperatur dem berechneten Tm entsprechen?

Nein. Die meisten Protokolle beginnen einige Grad unter dem berechneten Tm und passen die Temperatur von dort aus an, weil Tm den Punkt bezeichnet, an dem nur die Hälfte des Primers gebunden ist.

Verändert die Primerlänge Tm?

Ja, allerdings nicht auf einfache Weise. Die Länge steht im Nenner der Formel nach Marmur und Doty. Daher hat ein längerer Primer mit durchschnittlichem GC-Gehalt nicht automatisch ein höheres Tm als ein kürzerer, GC-reicher Primer.

Warum liefern verschiedene Tm-Rechner unterschiedliche Ergebnisse?

Sie verwenden verschiedene Formeln. Die Wallace-Regel, die GC-Gehalts-Formel nach Marmur und Doty, die Thermodynamik der benachbarten Basenpaare und salzgehaltskorrigierte Formeln können für denselben Primer jeweils ein anderes Tm ergeben, manchmal mit einem Unterschied von mehreren Grad.

Referenzen

1. Marmur J, Doty P. Bestimmung der Basenzusammensetzung von Desoxyribonukleinsäure anhand ihrer thermischen Denaturierungstemperatur. J Mol Biol. 1962;5(1):109-118.
2. Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. Hybridisierung synthetischer Oligodesoxyribonukleotide mit phi chi 174-DNA. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557.
3. SantaLucia J Jr. Eine einheitliche Betrachtung der Thermodynamik benachbarter Basenpaare bei Polymer-, Dumbbell- und Oligonukleotid-DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465.