DNA-Ligations-Rechner - Berechnen Sie Insert:Vektor-Verhältnisse für die molekulare Klonierung

Die DNA-Ligation ist der Schritt beim molekularen Klonieren, bei dem ein Insert-Fragment durch das Enzym T4-DNA-Ligase mit einem Plasmidvektor verbunden wird. Ein DNA-Ligationsrechner ermittelt, wie viele Mikroliter Insert-DNA und Vektor-DNA gemischt werden müssen, damit die Reaktion ein ausgewähltes molares Verhältnis von Insert zu Vektor erreicht.

Was der Rechner berechnet

Der Rechner benötigt sechs Eingaben: Vektorkonzentration, Vektorlänge, Insertkonzentration, Insertlänge, das gewünschte molare Verhältnis von Insert zu Vektor und das Gesamtvolumen der Reaktion. Außerdem kann festgelegt werden, wie viel Vektor-DNA verwendet werden soll; standardmäßig sind dies 50 Nanogramm (ng). Aus diesen Werten berechnet er das zu pipettierende Vektorvolumen, das zu pipettierende Insertvolumen und die Menge an Puffer oder Wasser, die zum Erreichen des Gesamtvolumens hinzugegeben werden muss.

Die Konzentration wird in Nanogramm pro Mikroliter (ng/μL) angegeben und üblicherweise mit einem Nanodrop- oder Qubit-Gerät bestimmt. Die Länge wird in Basenpaaren (bp) gemessen. Eine Kilobase (kb) entspricht 1000 Basenpaaren. Das molare Verhältnis beschreibt, wie viele Insert-Moleküle auf jeweils ein Vektormolekül kommen sollen. Es ist kein Massenverhältnis.

Warum das molare Verhältnis und nicht die Masse verwendet wird

Gleiche DNA-Massen enthalten nicht die gleiche Anzahl an Molekülen. Ein kurzes Insert wiegt bei gleicher Molekülzahl weniger als ein langer Vektor. Würde man gleiche Nanogramm-Mengen eines kurzen Inserts und eines langen Vektors mischen, wären im Verhältnis zu den Vektormolekülen viel zu wenige Insert-Moleküle vorhanden. Der Rechner skaliert die Insertmasse anhand des Verhältnisses der Fragmentlängen, sodass die Mischung die gewünschte Anzahl an Insert-Molekülen pro Vektormolekül enthält.

Formel für die DNA-Ligation

Die benötigte Menge an Insert-DNA in Nanogramm beträgt:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

wobei $m_i$ die Menge des Inserts in Nanogramm, $m_v$ die Menge des Vektors in Nanogramm, $k_i$ die Länge des Inserts in Kilobasen, $k_v$ die Länge des Vektors in Kilobasen und R das Ziel-Molverhältnis von Insert zu Vektor ist.

Sobald diese Menge bekannt ist, rechnet der Rechner beide Mengen in pipettierbare Volumina um:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

wobei $V_v$ und $V_i$ die Volumina des Vektors und des Inserts in Mikrolitern, $c_v$ und $c_i$ die Konzentrationen des Vektors und des Inserts in Nanogramm pro Mikroliter, $V_b$ das Puffervolumen und $V_t$ das Gesamtreaktionsvolumen sind.

Sind das Vektor- und das Insertvolumen zusammen größer als das Gesamtvolumen der Reaktion, bleibt kein Platz für Puffer, Ligase oder Wasser. In diesem Fall meldet der Rechner, dass das Gesamtvolumen zu klein ist, anstatt ein negatives Puffervolumen anzuzeigen.

Rechenbeispiel

Eine Forscherin kloniert ein 1-kb-Genfragment in einen 3-kb-Plasmidvektor. Geplant ist die Verwendung von 50 ng Vektor-DNA bei einem molaren Insert:Vektor-Verhältnis von 3:1 in einer Reaktion mit 20 μL.

Eingaben:

• Vektorkonzentration: 50 ng/μL
• Vektorlänge: 3000 bp (3 kb)
• Insertkonzentration: 25 ng/μL
• Insertlänge: 1000 bp (1 kb)
• Molares Verhältnis: 3
• Gesamtvolumen: 20 μL
• Vektormenge: 50 ng

Schritt 1: Insertmenge

ng Insert = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

Schritt 2: Volumina

Vektorvolumen = 50 ng ÷ 50 ng/μL = 1 μL

Insertvolumen = 50 ng ÷ 25 ng/μL = 2 μL

Puffervolumen = 20 − 1 − 2 = 17 μL

Die Reaktion besteht aus 1 μL Vektor, 2 μL Insert und 17 μL Puffer oder Wasser; an dieser Stelle werden auch die Ligase und ihr Reaktionspuffer hinzugegeben. Diese Mischung enthält drei Insert-Moleküle pro Vektormolekül.

Typische molare Verhältnisse für Ligationen

Beim üblichen Klonieren mit klebrigen, überstehenden Enden wird meist ein Insert:Vektor-Verhältnis von 3:1 verwendet. Ligationen stumpfer Enden sind weniger effizient, daher ist ein höheres Verhältnis wie 5:1 üblich. Bei sehr großen Inserts funktioniert manchmal ein niedrigeres Verhältnis von etwa 1:1 besser, da große Fragmente pro Molekül bereits viele Basenpaare beitragen.

Häufig gestellte Fragen

Was ist eine DNA-Ligation?

Eine DNA-Ligation ist die Verbindung zweier DNA-Fragmente, typischerweise eines Plasmidvektors und eines Inserts, zu einem einzigen durchgehenden Molekül. Das Enzym T4-DNA-Ligase schließt die Verbindung zwischen den Enden der Fragmente.

Was bedeutet das molare Insert:Vektor-Verhältnis?

Es gibt die Anzahl der Insert-DNA-Moleküle an, die in der Reaktion auf jeweils ein Vektormolekül kommen. Ein Verhältnis von 3:1 bedeutet drei Insert-Moleküle pro Vektormolekül, unabhängig davon, wie sich ihre Massen unterscheiden.

Warum verwendet man nicht gleiche Nanogramm-Mengen von Vektor und Insert?

DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge haben pro Molekül unterschiedliche Massen. Ein 1-kb-Insert wiegt pro Molekül etwa ein Drittel so viel wie ein 3-kb-Vektor. Gleiche Nanogramm-Mengen würden daher nicht die gleiche Molekülzahl ergeben, sodass der Rechner die Insertmasse an das gewünschte molare Verhältnis anpasst.

Was bedeutet es, wenn das Gesamtvolumen zu klein ist?

Das bedeutet, dass das Vektor- und das Insertvolumen allein bereits das gesamte Reaktionsvolumen aufbrauchen und kein Platz für Puffer oder Ligase bleibt. Abhilfe schaffen ein größeres Gesamtvolumen der Reaktion oder konzentriertere DNA-Stammlösungen.

Kann dieser Rechner für Gibson Assembly oder Golden-Gate-Klonieren verwendet werden?

Nein. Diese Methoden verwenden eine andere Reaktionschemie und zielen normalerweise auf äquimolare Mengen aller Fragmente statt auf ein festes Insert:Vektor-Verhältnis ab. Ihre Volumenberechnungen unterscheiden sich vom standardmäßigen Klonieren mit T4-Ligase.

Wie viel Vektor-DNA wird üblicherweise verwendet?

50 ng ist eine übliche Ausgangsmenge für eine Standard-Ligationsreaktion. In Laboren werden auch Mengen von 25 bis 100 ng verwendet, angepasst an die DNA-Konzentration und den Maßstab der Reaktion.