DNA-Konzentrationsrechner | A260 zu ng/μL Umrechner

Rechner für die DNA-Konzentration

Ein Rechner für die DNA-Konzentration wandelt einen UV-Absorbanzwert bei 260 Nanometern, bezeichnet als A260, in die DNA-Konzentration in Nanogramm pro Mikroliter (ng/µL) um. Außerdem gibt er die Gesamtmenge der DNA in einer Probe in Mikrogramm (µg) an.

Was bedeutet die Absorbanz A260?

A260 ist die Menge an ultraviolettem Licht, die eine Lösung bei einer Wellenlänge von 260 Nanometern absorbiert. DNA absorbiert aufgrund ihrer Nukleobasen UV-Licht in der Nähe dieser Wellenlänge am stärksten. Ein Spektralfotometer misst A260, nachdem eine Blindmessung mit demselben Puffer wie in der Probe die Hintergrundabsorbanz erfasst hat. Je mehr DNA in der Lösung vorhanden ist, desto höher ist der A260-Wert.

Formel für die DNA-Konzentration

Doppelsträngige DNA absorbiert UV-Licht proportional zu ihrer Konzentration; dieser Zusammenhang ist als Lambert-Beer-Gesetz bekannt. Bei einer üblichen Schichtdicke von 1 Zentimeter enthält eine Lösung mit einem A260-Wert von 1,0 etwa 50 ng/µL doppelsträngige DNA. Mit dieser Zahl, dem Umrechnungsfaktor 50 für DNA, lässt sich jeder A260-Wert in eine Konzentration umrechnen:

DNA-Konzentration (ng/µL) = A260 × 50 × Verdünnungsfaktor

Der Verdünnungsfaktor berücksichtigt jede Verdünnung, die vor der Messung der Probe vorgenommen wurde. Für eine unverdünnt gemessene Probe beträgt der Verdünnungsfaktor 1.

So wird die gesamte DNA-Ausbeute berechnet

Sobald die Konzentration bekannt ist, lässt sich die Gesamtmasse der DNA in der Probe anhand ihres Volumens bestimmen:

Gesamtmenge DNA (µg) = Konzentration (ng/µL) × Volumen (µL) ÷ 1000

DNA-Konzentration berechnen: Schritt für Schritt

1. Mischen Sie die Probe vor der Messung gründlich. DNA kann an den Wänden des Gefäßes haften oder sich ungleichmäßig absetzen.
2. Verdünnen Sie die Probe, wenn sie stark konzentriert ist, und zielen Sie auf einen A260-Wert zwischen 0,1 und 1,0. Außerhalb dieses Bereichs sind die Messwerte eines Spektralphotometers am wenigsten zuverlässig.
3. Führen Sie den Nullabgleich des Spektralphotometers mit demselben Puffer wie bei der Verdünnung durch und messen Sie die Probe bei 260 nm.
4. Geben Sie den A260-Wert, das Probenvolumen und den Verdünnungsfaktor in den Rechner ein, um die Konzentration und die Gesamtausbeute zu erhalten.

Beispiele

Beispiel 1: unverdünnte Probe

Ein A260-Wert von 0,5, keine Verdünnung (Verdünnungsfaktor 1) und ein Probenvolumen von 100 µL.

• Konzentration = 0,5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
• Gesamtmenge DNA = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 µg

Beispiel 2: verdünnte Probe

Eine Probe von 50 µL wurde vor der Messung auf das 10-Fache verdünnt und ergab einen A260-Wert von 0,75.

• Konzentration = 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
• Gesamtmenge DNA = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 µg

Verdünnungsfaktor berechnen

Verdünnungsfaktor = Gesamtvolumen nach der Verdünnung ÷ Volumen der ursprünglichen Probe.

Die Zugabe von 5 µL DNA-Lösung zu 45 µL Puffer ergibt ein Gesamtvolumen von 50 µL; der Verdünnungsfaktor beträgt daher 50 ÷ 5 = 10. Eine nicht verdünnte Probe hat einen Verdünnungsfaktor von 1.

Typische Bereiche der DNA-Konzentration

Die Konzentration hängt von der Probenart und der Extraktionsmethode ab. Ein Ergebnis, das weit außerhalb des für eine Methode erwarteten Bereichs liegt, kann auf ein Problem bei der Extraktion oder bei der Messung selbst hindeuten.

Grenzen der Messung durch UV-Absorbanz

Die Messung von A260 ist schnell, aber nicht die empfindlichste oder spezifischste Methode für DNA. Proteine, RNA und einige Pufferbestandteile absorbieren ebenfalls Licht in der Nähe von 260 nm und können den Messwert erhöhen. Zur Prüfung auf eine Proteinkontamination bestimmen Wissenschaftler häufig neben der Konzentration auch das Verhältnis A260/A280; ein Verhältnis nahe 1,8 weist gewöhnlich auf eine reine DNA-Probe hin. Methoden mit fluoreszenzbasierten Farbstoffen, etwa Qubit-Assays, binden nur an doppelsträngige DNA und liefern bei verdünnten oder verunreinigten Proben einen genaueren Wert, erfordern jedoch zusätzliche Reagenzien und ein Fluorometer.

Häufig gestellte Fragen

Wie wird die DNA-Konzentration aus A260 berechnet?

Den A260-Wert mit 50, dem Standard-Umrechnungsfaktor für doppelsträngige DNA, multiplizieren und anschließend mit dem Verdünnungsfaktor multiplizieren. Wurde die Probe nicht verdünnt, ist ein Verdünnungsfaktor von 1 zu verwenden.

Welches A260/A280-Verhältnis ist gut?

Ein Verhältnis nahe 1,8 weist gewöhnlich auf eine reine DNA-Probe hin. Ein niedrigeres Verhältnis deutet auf eine Proteinkontamination hin. Ein Verhältnis über 2,0 kann auf eine RNA-Kontamination hindeuten.

Kann dieser Rechner für RNA verwendet werden?

Nicht direkt, da für RNA ein Umrechnungsfaktor von 40 ng/µL statt 50 verwendet wird. Um die RNA-Konzentration zu schätzen, das Ergebnis des Rechners mit 0,8 (40 ÷ 50) multiplizieren oder direkt A260 × 40 × Verdünnungsfaktor verwenden.

Warum sollte der A260-Wert zwischen 0,1 und 1,0 liegen?

Die Absorbanz bleibt hauptsächlich innerhalb dieses Bereichs ungefähr proportional zur Konzentration, wie es das Beer-Lambert-Gesetz beschreibt. Außerhalb dieses Bereichs werden die Messwerte weniger zuverlässig. Eine zu konzentrierte oder zu verdünnte Probe sollte daher vor einer erneuten Messung verdünnt oder konzentriert werden.

Was ist der Unterschied zwischen Konzentration und Reinheit?

Die Konzentration gibt an, wie viel DNA in ng/µL vorhanden ist. Die Reinheit beschreibt, wie sauber die Probe ist, und wird hauptsächlich anhand von Absorbanzverhältnissen wie A260/A280 beurteilt. Eine Probe kann eine hohe Konzentration aufweisen und trotzdem verunreinigt sein oder eine niedrige Konzentration und eine sehr hohe Reinheit haben.

Wie wird ng/µL in µg/mL umgerechnet?

Die beiden Einheiten sind zahlenmäßig gleich. 1 ng/µL entspricht 1 µg/mL, weil sowohl die Masseneinheit als auch die Volumeneinheit mit dem Faktor 1000 skaliert werden.

Referenzen

1. Desjardins, P., & Conklin, D. (2010). NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. Journal of Visualized Experiments. Volltext in PubMed Central – Konzentrationskonstanten von 50 für DNA und 40 für RNA; A260/A280-Verhältnis von etwa 1,8 bei reiner DNA; niedrigere Verhältnisse deuten auf Proteine oder andere Verunreinigungen hin.
2. Massachusetts Institute of Technology, OpenCourseWare. 7.13 Experimental Microbial Genetics: UV spectrophotometric measurement of DNA concentration and purity. MIT-OCW-Protokoll zur Spektralphotometrie – Für eine genaue Messung muss der A260-Wert zwischen 0,1 und 1 liegen.