DNA-Konzentrationsrechner | A260 zu ng/μL Umrechner

Rechner für die DNA-Konzentration

Ein Rechner für die DNA-Konzentration wandelt einen UV-Absorbanzwert bei 260 Nanometern, bezeichnet als A260, in die DNA-Konzentration in Nanogramm pro Mikroliter (ng/µL) um. Außerdem gibt er die Gesamtmenge der DNA in einer Probe in Mikrogramm (µg) an.

Was bedeutet die Absorbanz A260?

A260 ist die Menge an ultraviolettem Licht, die eine Lösung bei einer Wellenlänge von 260 Nanometern absorbiert. DNA absorbiert aufgrund ihrer Nukleobasen UV-Licht in der Nähe dieser Wellenlänge am stärksten. Ein Spektralfotometer misst A260, nachdem eine Blindmessung mit demselben Puffer wie in der Probe die Hintergrundabsorbanz erfasst hat. Je mehr DNA in der Lösung vorhanden ist, desto höher ist der A260-Wert.

Formel für die DNA-Konzentration

D doppelsträngige DNA absorbiert UV-Licht proportional zu ihrer Konzentration; dieser Zusammenhang wird als Beer-Lambert-Gesetz bezeichnet. Bei einem standardmäßigen Lichtweg von 1 Zentimeter enthält eine Lösung mit einem A260-Wert von 1,0 etwa 50 ng/µL doppelsträngige DNA. Diese Zahl, der Umrechnungsfaktor, wandelt jeden A260-Wert in eine Konzentration um:

DNA-Konzentration (ng/µL) = A260 × 50 × Verdünnungsfaktor

Der Verdünnungsfaktor berücksichtigt jede Verdünnung, die vor der Messung der Probe vorgenommen wurde. Für eine unverdünnt gemessene Probe beträgt der Verdünnungsfaktor 1.

So wird die gesamte DNA-Ausbeute berechnet

Sobald die Konzentration bekannt ist, lässt sich die Gesamtmasse der DNA in der Probe anhand ihres Volumens bestimmen:

Gesamtmenge DNA (µg) = Konzentration (ng/µL) × Volumen (µL) ÷ 1000

DNA-Konzentration berechnen: Schritt für Schritt

1. Die Probe vor der Messung gründlich mischen. DNA kann an den Wänden des Gefäßes haften oder sich ungleichmäßig absetzen.
2. Eine hochkonzentrierte Probe verdünnen und dabei einen A260-Wert zwischen 0,1 und 1,0 anstreben. Außerhalb dieses Bereichs sind die Messwerte des Spektralfotometers am wenigsten zuverlässig.
3. Das Spektralfotometer mit demselben Puffer wie bei der Verdünnung nullstellen und die Probe bei 260 nm messen.
4. Den A260-Wert, das Probenvolumen und den Verdünnungsfaktor in den Rechner eingeben, um die Konzentration und die Gesamtausbeute zu erhalten. Alle drei Felder müssen ausgefüllt sein, und das Volumen muss größer als null sein, bevor ein Ergebnis angezeigt wird.

Durchgerechnetes Beispiel

Beispiel 1: unverdünnte Probe

Ein A260-Wert von 0,5, keine Verdünnung (Verdünnungsfaktor 1) und ein Probenvolumen von 100 µL.

• Konzentration = 0,5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
• Gesamtmenge DNA = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 µg

Beispiel 2: verdünnte Probe

Ein Gefäß enthält 50 µL gereinigte DNA. Ein kleiner Teil davon wurde 10-fach verdünnt, und der verdünnte Teil ergab einen A260-Wert von 0,75. Der Verdünnungsfaktor rechnet diesen Wert auf die Konzentration im ursprünglichen Gefäß zurück; 50 µL ist das für die Berechnung der Gesamtausbeute eingegebene Volumen.

• Konzentration = 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
• Gesamtmenge DNA = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 µg

Verdünnungsfaktor berechnen

Verdünnungsfaktor = Gesamtvolumen nach der Verdünnung ÷ Volumen der ursprünglichen Probe.

Die Zugabe von 5 µL DNA-Lösung zu 45 µL Puffer ergibt ein Gesamtvolumen von 50 µL; der Verdünnungsfaktor beträgt daher 50 ÷ 5 = 10. Eine nicht verdünnte Probe hat einen Verdünnungsfaktor von 1.

Typische Bereiche der DNA-Konzentration

Die Konzentration hängt vom Probentyp und vom Extraktionsverfahren ab. Bei genomischen DNA-Extraktionen liegt sie häufig ungefähr zwischen 10 und 100 ng/µL. Plasmid-DNA-Präparationen ergeben oft höhere Konzentrationen, manchmal mehrere hundert ng/µL. Ein Wert, der deutlich außerhalb des für ein bestimmtes Verfahren erwarteten Bereichs liegt, kann auf ein Problem bei der Extraktion oder der Messung selbst hinweisen.

Grenzen der Messung durch UV-Absorbanz

Die Messung von A260 ist schnell, aber nicht die empfindlichste oder spezifischste Methode für DNA. Proteine, RNA und einige Pufferbestandteile absorbieren ebenfalls Licht in der Nähe von 260 nm und können den Messwert erhöhen. Zur Prüfung auf eine Proteinkontamination bestimmen Wissenschaftler häufig neben der Konzentration auch das Verhältnis A260/A280; ein Verhältnis nahe 1,8 weist gewöhnlich auf eine reine DNA-Probe hin. Methoden mit fluoreszenzbasierten Farbstoffen, etwa Qubit-Assays, binden nur an doppelsträngige DNA und liefern bei verdünnten oder verunreinigten Proben einen genaueren Wert, erfordern jedoch zusätzliche Reagenzien und ein Fluorometer.

Häufig gestellte Fragen

Wie wird die DNA-Konzentration aus A260 berechnet?

Den A260-Wert mit 50, dem Standard-Umrechnungsfaktor für doppelsträngige DNA, multiplizieren und anschließend mit dem Verdünnungsfaktor multiplizieren. Wurde die Probe nicht verdünnt, ist ein Verdünnungsfaktor von 1 zu verwenden.

Welches A260/A280-Verhältnis ist gut?

Ein Verhältnis nahe 1,8 weist gewöhnlich auf eine reine DNA-Probe hin. Ein niedrigeres Verhältnis deutet auf eine Proteinkontamination hin. Ein Verhältnis über 2,0 kann auf eine RNA-Kontamination hindeuten.

Kann dieser Rechner für RNA verwendet werden?

Nicht direkt, da für RNA ein Umrechnungsfaktor von 40 ng/µL statt 50 verwendet wird. Um die RNA-Konzentration zu schätzen, das Ergebnis des Rechners mit 0,8 (40 ÷ 50) multiplizieren oder direkt A260 × 40 × Verdünnungsfaktor verwenden.

Warum sollte der A260-Wert zwischen 0,1 und 1,0 liegen?

Die Absorbanz bleibt hauptsächlich innerhalb dieses Bereichs ungefähr proportional zur Konzentration, wie es das Beer-Lambert-Gesetz beschreibt. Außerhalb dieses Bereichs werden die Messwerte weniger zuverlässig. Eine zu konzentrierte oder zu verdünnte Probe sollte daher vor einer erneuten Messung verdünnt oder konzentriert werden.

Was ist der Unterschied zwischen Konzentration und Reinheit?

Die Konzentration gibt an, wie viel DNA in ng/µL vorhanden ist. Die Reinheit beschreibt, wie sauber die Probe ist, und wird hauptsächlich anhand von Absorbanzverhältnissen wie A260/A280 beurteilt. Eine Probe kann eine hohe Konzentration aufweisen und trotzdem verunreinigt sein oder eine niedrige Konzentration und eine sehr hohe Reinheit haben.

Wie wird ng/µL in µg/mL umgerechnet?

Die beiden Einheiten sind zahlenmäßig gleich. 1 ng/µL entspricht 1 µg/mL, weil sowohl die Masseneinheit als auch die Volumeneinheit mit dem Faktor 1000 skaliert werden.

Referenzen

1. Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3. Aufl.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
2. Gallagher, S. R., & Desjardins, P. R. (2006). Quantifizierung von DNA und RNA mittels Absorptions- und Fluoreszenzspektroskopie. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
3. Manchester, K. L. (1995). Der Wert des A260/A280-Verhältnisses zur Bestimmung der Reinheit von Nukleinsäuren. BioTechniques, 19(2), 208–210.