DNA-Kopienzahlrechner | Genomische Analysewerkzeug

DNA-Kopienzahl-Rechner

Ein DNA-Kopienzahl-Rechner schätzt, wie viele Kopien einer Zielsequenz in einer DNA-Probe vorhanden sind. Er verwendet die Konzentration und das Volumen der Probe sowie die Häufigkeit, mit der die Zielsequenz innerhalb der längeren DNA-Sequenz vorkommt. Molekularbiologische Labore nutzen diese Schätzung, um Experimente wie qPCR (quantitative Polymerase-Kettenreaktion) zu planen, bevor sie eine teurere und präzisere Analyse durchführen.

Bedeutung der DNA-Kopienzahl

Die DNA-Kopienzahl gibt an, wie oft eine bestimmte Sequenz in einem Genom oder einer Probe vorkommt. Ein typisches menschliches Gen kommt zweimal vor, jeweils einmal von jedem Elternteil geerbt. Verschiedene Faktoren können diese Anzahl verändern.

• Amplifikation: mehr als zwei Kopien. Krebszellen amplifizieren häufig wachstumsfördernde Gene, beispielsweise HER2 in manchen Brusttumoren.
• Deletion: weniger als zwei Kopien, manchmal keine. Deletionen können genetische Erkrankungen verursachen.
• Duplikation: Eine zusätzliche Kopie tritt dort auf, wo nur eine oder zwei vorhanden sein sollten.
• Kopienzahlvariation (CNV): ein Unterschied in der Kopienzahl zwischen Individuen, der in einem beträchtlichen Teil des menschlichen Genoms vorkommt.

Formel für die DNA-Kopienzahl

Der Rechner wandelt die Anzahl der Sequenzvorkommen und die Probenmasse mit dieser Formel in eine Kopienzahl um:

$\text{Kopienzahl} = \frac{\text{Vorkommen} \times \text{Konzentration} \times \text{Volumen} \times N_A}{\text{DNA-Länge} \times 660 \times 10^{9}}$

Dabei gilt:

• Vorkommen — wie oft die Zielsequenz in der vollständigen DNA-Sequenz vorkommt; überlappende Treffer werden separat gezählt.
• Konzentration — DNA-Konzentration in Nanogramm pro Mikroliter (ng/μL), die gewöhnlich mit einem Spektrophotometer oder Fluorometer gemessen wird.
• Volumen — Probenvolumen in Mikrolitern (μL).
• $N_A$ — die Avogadro-Konstante, 6,022 × 10²³ Moleküle pro Mol. Sie rechnet die Stoffmenge der DNA in Mol in eine Molekülzahl um.
• DNA-Länge — Länge der vollständigen DNA-Sequenz in Basenpaaren.
• 660 — das durchschnittliche Molekulargewicht eines DNA-Basenpaars in Gramm pro Mol (g/mol). Ein Basenpaar besteht aus zwei gepaarten Nukleotiden, je eines aus jedem DNA-Strang.
• 10⁹ — rechnet Nanogramm in Gramm um.

Die Formel wandelt zunächst die Masse der Probe in die Stoffmenge der DNA-Moleküle um, multipliziert diese mit der Avogadro-Konstante, um die Gesamtzahl der DNA-Moleküle in der Probe zu erhalten, und multipliziert sie anschließend mit der Anzahl der Vorkommen der Zielsequenz in jedem Molekül.

Berechnung der DNA-Kopienzahl: durchgerechnetes Beispiel

Gegeben sei eine DNA-Sequenz mit 12 Basenpaaren, ATCGATCGATCG, mit einer Zielsequenz ATCG, einer Konzentration von 10 ng/μL und einem Volumen von 20 μL.

Schritt 1: Zählen Sie die Vorkommen. ATCG kommt in ATCGATCGATCG 3-mal vor, an den Positionen 1, 5 und 9.

Schritt 2: Bestimmen Sie die gesamte DNA-Masse. Konzentration × Volumen = 10 × 20 = 200 ng.

Schritt 3: Rechnen Sie in Mol um. 200 ng = 2 × 10⁻⁷ g. Teilen Sie durch (12 Basenpaare × 660 g/mol) = 7.920 g/mol. Daraus ergeben sich 2,53 × 10⁻¹¹ mol.

Schritt 4: Rechnen Sie in eine Molekülzahl um. Multiplizieren Sie mit der Avogadro-Konstante: 2,53 × 10⁻¹¹ mol × 6,022 × 10²³ Moleküle/mol ≈ 1,52 × 10¹³ DNA-Moleküle.

Schritt 5: Multiplizieren Sie mit der Anzahl der Vorkommen. 3 × 1,52 × 10¹³ ≈ 4,56 × 10¹³ oder etwa 45.621.212.121.212 Kopien.

Diese Zahl wirkt sehr groß, weil eine 20 μL große Probe mit 10 ng/μL noch Billionen kurzer DNA-Moleküle enthält. In realen Proben sind die Sequenzen gewöhnlich viel länger, wodurch sich bei gleicher Masse die Molekülzahl verringert.

Anwendungsbereiche der DNA-Kopienzahlanalyse

Krebsdiagnostik. Pathologielabore bestimmen die HER2-Kopienzahl in Brusttumorgewebe. Eine normale Zelle trägt zwei Kopien. Ein amplifizierter Tumor kann sechs oder mehr tragen, was die Eignung für zielgerichtete Medikamente wie Trastuzumab beeinflusst.

Gentests bei Erbkrankheiten. Erkrankungen wie das DiGeorge-Syndrom beruhen auf der Deletion eines Chromosomenabschnitts. Das Down-Syndrom beruht auf einer zusätzlichen Kopie von Chromosom 21 (Trisomie 21). Das Zählen der Kopien hilft, diese Diagnosen zu bestätigen.

Quantifizierung von Transgenen und Plasmiden. Forschende prüfen, wie viele Kopien eines eingefügten Gens in eine pflanzliche, tierische oder bakterielle Zelle gelangt sind. Eine einzelne Kopie wird gewöhnlich bevorzugt, da mehrere Kopien die Zelle dazu veranlassen können, das Gen stillzulegen.

Überwachung von Krankheitserregern und Viruslast. Schätzungen der Kopienzahl zeigen, wie viel virale oder bakterielle DNA in einer Probe vorhanden ist. Dies wird bei der Überwachung von Infektionen und bei Umweltuntersuchungen eingesetzt.

Andere Methoden zur Messung der Kopienzahl

Dieser Rechner liefert anhand von Sequenz- und Konzentrationsdaten eine schnelle Schätzung. Labore, die eine höhere Präzision benötigen, verwenden typischerweise stattdessen eine der folgenden Methoden:

• Quantitative PCR (qPCR): amplifiziert und misst DNA in Echtzeit; bei einer guten Standardkurve auf etwa 15–20% genau.
• Digitale PCR (dPCR): teilt eine Probe für die direkte Zählung in Tausende winzige Reaktionen auf, ohne dass eine Standardkurve erforderlich ist.
• Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH): zählt Sequenzen direkt an Zellen oder Chromosomen unter dem Mikroskop; in vielen Labors der Krebsdiagnostik die Standardmethode.
• Sequenzierung der nächsten Generation (NGS): sequenziert die gesamte Probe und erstellt gleichzeitig ein Kopienzahlprofil für das gesamte Genom.

Häufig gestellte Fragen

Was ist die DNA-Kopienzahl? Sie gibt an, wie oft eine bestimmte DNA-Sequenz in einem Genom oder einer Probe vorkommt. Die meisten menschlichen Gene kommen zweimal vor, je einmal von jedem Elternteil. Zusätzliche oder fehlende Kopien können die Gesundheit und das Krankheitsrisiko beeinflussen.

Wie genau ist dieser Rechner? Er liefert eine theoretische Schätzung auf Grundlage der eingegebenen Werte, keine Labormessung. Die Genauigkeit hängt davon ab, wie präzise die Konzentration gemessen wurde und wie spezifisch die Zielsequenz ist. Methoden wie die digitale PCR sind für veröffentlichte Ergebnisse genauer.

Kann dieser Rechner für RNA verwendet werden? Nein. RNA enthält Uracil statt Thymin und einen anderen Zucker, daher unterscheidet sich ihr Molekulargewicht von dem der DNA. RNA hat ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 330 g/mol pro Nukleotid, verglichen mit etwa 660 g/mol pro DNA-Basenpaar. Die DNA-Formel auf RNA-Daten anzuwenden, würde ein falsches Ergebnis liefern.

Warum zählt eine überlappende Sequenz mehr als einmal? Der Rechner zählt jede Position, an der das Ziel übereinstimmt, auch wenn sich Treffer Buchstaben teilen. In ATATAT stimmt die Sequenz ATA zweimal überein, an Position 1 und an Position 3, weil jede Startposition unabhängig geprüft wird.

Welcher DNA-Konzentrationsbereich eignet sich am besten? Konzentrationen von 10–100 ng/μL liefern auf üblichen Laborgeräten die zuverlässigsten Messwerte. Unterhalb von 10 ng/μL nimmt der Messfehler zu, und eine empfindlichere Methode wie ein Fluorometer wird einem Standard-Spektrophotometer vorgezogen.

Kann dieser Rechner die Plasmid-Kopienzahl schätzen? Ja. Geben Sie die vollständige Plasmidsequenz als DNA-Sequenz und eine eindeutige Region des Inserts als Zielsequenz ein, zusammen mit der gemessenen Plasmidkonzentration und dem Probenvolumen.

Referenzen

1. National Human Genome Research Institute. Copy Number Variation (CNV). NHGRI-Glossar der Genetik: CNV — Die Kopienzahl eines DNA-Abschnitts unterscheidet sich zwischen Individuen.
2. National Institute of Standards and Technology. CODATA value: Avogadro constant. NIST: Avogadro-Konstante — 6,022 140 76 × 10²³ mol⁻¹ (exakt).
3. MedlinePlus Genetics, U.S. National Library of Medicine. 22q11.2 deletion syndrome. 22q11.2-Deletionssyndrom — Das DiGeorge-Syndrom wird durch die Deletion eines kleinen Stücks von Chromosom 22 verursacht.
4. MedlinePlus Genetics, U.S. National Library of Medicine. Down syndrome. Down-Syndrom — Trisomie 21 bedeutet drei Kopien von Chromosom 21 statt zwei.