Serienverdünnungsrechner - Laborkonzentrationstool

Ein Rechner für serielle Verdünnungen ermittelt die Konzentration eines Stoffes bei jedem Schritt einer Verdünnungsreihe. Eine serielle Verdünnung ist ein Laborverfahren, bei dem die Konzentration einer Lösung schrittweise verringert wird, wobei jeder neue Schritt die vorherige Stufe um denselben Faktor verdünnt.

Was ist eine serielle Verdünnung?

Die serielle Verdünnung löst ein häufiges Problem im Labor: Eine Probe ist zu konzentriert, um sie direkt zu messen oder zu verwenden. Statt in einem einzigen Schritt ein winziges und fehleranfälliges Volumen abzumessen, verdünnt eine Wissenschaftlerin oder ein Wissenschaftler die Probe mehrmals hintereinander und verwendet dabei in jedem Schritt ein kleines, gut handhabbares Volumen.

Jede Verdünnung beginnt mit dem Ergebnis der vorherigen und nicht mit der ursprünglichen Probe. Dadurch entsteht eine Konzentrationsreihe, die sich jedes Mal um denselben Faktor verringert. Das Verfahren wird zum Zählen von Bakterien, zum Testen der Wirkung eines Arzneimittels auf Zellen bei unterschiedlichen Dosen, zum Erstellen von Kalibrierkurven für Laborassays und zum Vorbereiten von DNA-Proben für die PCR verwendet.

Formel der seriellen Verdünnung

Für jeden Verdünnungsschritt gilt folgende Formel:

$C_2 = \frac{C_1}{DF}$

• C₁ ist die Konzentration vor dem Schritt
• DF ist der Verdünnungsfaktor
• C₂ ist die Konzentration nach dem Schritt

Um die Konzentration nach mehreren Schritten auf einmal zu bestimmen, verwendet man:

$C_n = \frac{C_0}{DF^n}$

• C₀ ist die Ausgangskonzentration
• DF ist der Verdünnungsfaktor
• n ist die Anzahl der Schritte
• C_n ist die Konzentration nach n Schritten

Der Verdünnungsfaktor muss größer als 1 sein. Ein Faktor von 1 würde bedeuten, dass überhaupt keine Verdünnung stattfindet. Die Ausgangskonzentration muss größer als 0 sein.

Dieser Rechner umfasst 1 bis 20 Schritte und führt daneben Schritt 0, die unverdünnte Probe, auf. Die Einheit der Konzentration wird als reines Textlabel angegeben, etwa mg/mL oder KBE/mL, und jede Zeile wird in derselben Einheit angegeben. Konzentrationen werden mit sechs signifikanten Stellen angezeigt. Werte unter 0,000001 werden in die wissenschaftliche Schreibweise umgewandelt, damit ein kleines Ergebnis niemals als null angezeigt wird.

Verdünnungsfaktor und Verdünnungsverhältnis

Ein Verdünnungsfaktor von 10 wird häufig als Verhältnis 1:10 angegeben. Das Verhältnis beschreibt die Anteile und nicht den Faktor selbst: 1 Teil Probe plus 9 Teile Verdünnungsmittel ergeben insgesamt 10 Teile. Der Faktor gibt an, um wie viel stärker die neue Lösung verdünnt ist. Daher entspricht ein Verhältnis von 1:10 einem Verdünnungsfaktor von 10 und nicht von 11.

Häufige Verdünnungsfaktoren sind:

• 10 (1:10): die übliche Wahl in der Mikrobiologie, da damit ein großer Konzentrationsbereich mit wenigen Schritten abgedeckt wird.
• 2 (1:2): in der Pharmakologie häufig, wenn für eine Dosis-Wirkungs-Kurve feinere Abstufungen benötigt werden.
• 5 (1:5): eine mittlere Option, die mehr Datenpunkte als 1:10 liefert, aber weniger Schritte als 1:2 erfordert.

Beispiel: Verdünnung einer Bakterienkultur

Eine Flüssigkultur enthält schätzungsweise 10⁸ koloniebildende Einheiten (KBE) pro Milliliter und ist zu dicht, um direkt gezählt zu werden. Für die Zählung müssen sich zwischen 30 und 300 Kolonien pro Platte befinden. Daher benötigt die Probe eine 1:10-Reihe mit 6 Schritten.

Das Ausplattieren von 100 μL (0,1 mL) aus Schritt 5 ergibt etwa 10² = 100 KBE auf der Platte und liegt damit im zählbaren Bereich.

Beispiel: Eine zweifache Verdünnungsreihe eines Arzneimittels

Für ein Arzneimittel wird ein IC50-Wert (die Konzentration, die die Aktivität um die Hälfte verringert) in der Nähe von 25 mg/mL erwartet. Um einen Bereich um diesen Wert zu testen, ist eine 1:2-Reihe erforderlich, die bei 100 mg/mL beginnt und 5 Schritte umfasst.

Diese Reihe grenzt den erwarteten IC50-Wert ein und liefert genügend Punkte zum Erstellen einer Dosis-Wirkungs-Kurve.

Durchführung einer seriellen Verdünnung

1. Vor Beginn jedes Röhrchen mit der Schrittzahl und dem Verdünnungsfaktor beschriften.
2. In jedes Röhrchen außer dem mit der ursprünglichen Probe Verdünnungsmittel geben. Bei einer 1:10-Reihe 9 Volumen Verdünnungsmittel zu 1 Volumen geben, das die Probe aufnehmen wird.
3. Ein abgemessenes Volumen der ursprünglichen Probe in das erste Röhrchen überführen und gründlich mischen, entweder durch Vortexen oder durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren.
4. Mit einer neuen Pipettenspitze dasselbe Volumen aus dem ersten Röhrchen in das zweite überführen und erneut mischen.
5. Den Schritt des Überführens und Mischens für jedes weitere Röhrchen wiederholen.
6. Die verdünnten Proben zeitnah verwenden, da lebende Zellen weiterwachsen und manche Verbindungen mit der Zeit abgebaut werden.

Anwendungsbereiche der seriellen Verdünnung

In der Mikrobiologie wird die serielle Verdünnung für die Bestimmung von Bakterienzahlen auf Platten und für Tests der minimalen Hemmkonzentration (MHK) verwendet, mit denen die niedrigste Antibiotikadosis ermittelt wird, die das Bakterienwachstum stoppt. In der Biochemie dient sie zum Erstellen von Standardkurven für Proteinassays und zum Vorbereiten von DNA-Templates für die PCR in einer geeigneten Konzentration. In der Pharmakologie werden Verdünnungsreihen verwendet, um Arzneimittel über einen Dosisbereich zu testen und Werte wie IC50 zu berechnen. In der Immunologie dienen sie zur Erstellung von ELISA-Kalibrierkurven und zur Antikörpertitration, bei der die höchste Verdünnung angegeben wird, die noch ein positives Ergebnis liefert.

Häufige Fehler

Unzureichendes Mischen der einzelnen Röhrchen ist eine häufige Fehlerquelle, da sich Partikel und Zellen absetzen können, anstatt gleichmäßig verteilt zu bleiben. Die Wiederverwendung einer Pipettenspitze kann genügend Material aus einem stärker konzentrierten Röhrchen übertragen, um spätere Messwerte zu verfälschen. Die Verwechslung von Verdünnungsverhältnis und Verdünnungsfaktor führt zu falschen Volumina: Eine 1:10-Verdünnung bedeutet 1 Teil Probe plus 9 Teile Verdünnungsmittel und nicht 1 Teil plus 10. Wird die Konzentration bei jedem Schritt gerundet, statt den Endwert direkt aus C₀/DF^n zu berechnen, kann sich über mehrere Schritte ein deutlicher Fehler aufbauen.

Historie

Robert Koch entwickelte in den 1880er-Jahren bei der Untersuchung von Tuberkulose und Cholera quantitative Methoden zur Zählung von Bakterienkolonien und legte damit die Grundlage für das noch heute verwendete Plattenzählverfahren. Die von Heinrich Schnitger in 1957 erfundene Luftpolster-Mikropipette ermöglichte später die genaue Messung von Mikrolitervolumina und machte feine, reproduzierbare Verdünnungsreihen für die Molekularbiologie und Immunoassays praktisch nutzbar.

Häufig gestellte Fragen

Wie berechnet man eine serielle Verdünnung? Verwenden Sie C_n = C₀ / DF^n, wobei C₀ die Ausgangskonzentration, DF der Verdünnungsfaktor und n die Anzahl der Schritte ist. Beispielsweise ergibt 100 mg/mL, über 3 Schritte um den Faktor 10 verdünnt, 100 / 10³ = 0,1 mg/mL.

Was ist der Unterschied zwischen Verdünnungsfaktor und Verdünnungsverhältnis? Das Verdünnungsverhältnis, etwa 1:10, beschreibt die Anteile: 1 Teil Probe wird mit 9 Teilen Verdünnungsmittel zu insgesamt 10 Teilen gemischt. Der Verdünnungsfaktor ist die Zahl 10 selbst und bedeutet, dass die Lösung zehnmal weniger konzentriert ist.

Warum verwendet man mehrere kleine Verdünnungsschritte statt einer großen Verdünnung? Kleine Übertragungen mit gleichem Volumen lassen sich genauer pipettieren als eine einzige sehr große Verdünnung. Eine Reihe aus sechs 1:10-Schritten erreicht ebenfalls eine millionenfache Verdünnung, einen Bereich, der in einem einzigen Schritt nur schwer genau zu erzielen ist.

Wie genau ist eine serielle Verdünnung? Mit kalibrierten Pipetten und sorgfältiger Arbeitsweise ist eine Reihe typischerweise auf 5 bis 10 Prozent genau, was für die meisten Arbeiten in der Mikrobiologie ausreicht. Anwendungen mit höheren Genauigkeitsanforderungen, etwa pharmazeutische Standards, verwenden häufig stattdessen parallele Verdünnungen, die direkt aus der Stammlösung hergestellt werden.

Wie viele Verdünnungsschritte sind maximal sinnvoll? Dieser Rechner erlaubt bis zu 20 Schritte. Die meisten Laborprotokolle verwenden 6 bis 10, da sich der Fehler mit jeder weiteren Übertragung vergrößert. Ein größerer Verdünnungsfaktor verringert die erforderliche Schrittzahl. Drei Schritte mit 1:100 erreichen beispielsweise dieselbe Verdünnung von 10⁻⁶ wie sechs Schritte mit 1:10.

Kann sich der Verdünnungsfaktor zwischen den Schritten derselben Reihe ändern? Ja, aber in den meisten Protokollen bleibt der Faktor konstant, da sich ein fester Faktor einfacher berechnen, pipettieren und reproduzieren lässt. Eine variable Reihe wird gelegentlich verwendet, wenn für einen Teil des Konzentrationsbereichs eine feinere Auflösung benötigt wird als für einen anderen.