Zellverdünnungsrechner - Präzises Laborverdünnungstool

Rechner zur Zellverdünnung

Ein Rechner zur Zellverdünnung ermittelt, wie viel Zellsuspension und wie viel Verdünnungsmittel miteinander gemischt werden müssen, um in einem gewählten Endvolumen eine bestimmte Zellkonzentration zu erreichen. Er wird in der Zellkultur, der Mikrobiologie und anderen Laborbereichen eingesetzt, wenn eine Probe vor der Verwendung auf eine genau festgelegte Konzentration gebracht werden muss.

Was Zellverdünnung bedeutet

Durch das Verdünnen einer Zellsuspension ändert sich die Anzahl der darin enthaltenen Zellen nicht. Es ändert sich nur das Volumen, in dem sich die Zellen befinden, wodurch die Konzentration sinkt. Eine Suspension mit einer Konzentration von 1.000.000 Zellen pro Milliliter (Zellen/mL) enthält auch nach der Verdünnung dieselbe Gesamtzahl an Zellen. Diese ist lediglich auf mehr Flüssigkeit verteilt.

Im Labor werden Zellen vor vielen routinemäßigen Arbeitsschritten verdünnt: beim Aufteilen einer wachsenden Kultur auf neue Kolben, beim Ausplattieren einer festgelegten Zellzahl in jede Vertiefung einer Platte, beim Einfrieren von Zellen zur Lagerung oder beim Vorbereiten einer Probe für einen Zellzähler oder ein Durchflusszytometer.

Formel zur Zellverdünnung

Die Berechnung beruht auf einer Regel. Die aus der Stammsuspension entnommene Zellmenge, multipliziert mit ihrer Konzentration, muss der Zellmenge im Endvolumen, multipliziert mit der Zielkonzentration, entsprechen:

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

• C₁ — Ausgangs- (Stamm-)konzentration in Zellen/mL
• V₁ — zu verwendendes Volumen der Stammsuspension in mL
• C₂ — Zielkonzentration in Zellen/mL
• V₂ — benötigtes gesamtes Endvolumen in mL

Durch Auflösen nach V₁ erhält man das Volumen der Stammsuspension, das pipettiert werden muss:

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁

Der restliche Anteil des Endvolumens besteht aus Verdünnungsmittel, meist Zellkulturmedium, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder einem anderen Puffer:

Volumen des Verdünnungsmittels = V₂ − V₁

Die Zielkonzentration (C₂) kann niemals höher sein als die Stammkonzentration (C₁). Durch Verdünnen sinkt die Konzentration nur. Um sie zu erhöhen, müssen die Zellen abzentrifugiert und in weniger Flüssigkeit resuspendiert werden.

Zellverdünnung berechnen

1. Die Stammsuspension mit einer Zählkammer oder einem automatischen Zellzähler zählen, um C₁ zu bestimmen.
2. Die im Protokoll geforderte Zielkonzentration C₂ notieren.
3. Das erforderliche gesamte Endvolumen V₂ festlegen.
4. V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ berechnen.
5. Das Volumen des Verdünnungsmittels als V₂ − V₁ berechnen.
6. V₁ der Stammsuspension in ein Röhrchen pipettieren und anschließend das berechnete Volumen an Medium oder Puffer hinzufügen.

Durchgerechnetes Beispiel

Eine Stammsuspension wird mit 1.000.000 Zellen/mL gezählt. Ein Protokoll verlangt 100.000 Zellen/mL in einem Endvolumen von 10 mL.

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ = (100.000 × 10) ÷ 1.000.000 = 1.000.000 ÷ 1.000.000 = 1 mL

Volumen des Verdünnungsmittels = V₂ − V₁ = 10 − 1 = 9 mL

Die Zugabe von 1 mL Stammsuspension zu 9 mL Medium ergibt 10 mL Suspension mit 100.000 Zellen/mL.

Ein zweites Beispiel

Für einen Assay in einer Platte mit 96 Vertiefungen werden 10.000 Zellen pro Vertiefung in 200 Mikrolitern (μL) Medium pro Vertiefung benötigt. Das entspricht einer Zielkonzentration von 50.000 Zellen/mL, da 10.000 Zellen geteilt durch 0,2 mL 50.000 Zellen/mL ergibt. Die Stammkonzentration beträgt 2.000.000 Zellen/mL, und insgesamt werden 20 mL benötigt, damit die Platte mit etwas Reserve für Pipettierverluste befüllt werden kann.

V₁ = (50.000 × 20) ÷ 2.000.000 = 1.000.000 ÷ 2.000.000 = 0,5 mL

Volumen des Verdünnungsmittels = 20 − 0,5 = 19,5 mL

Das Mischen von 0,5 mL Stammsuspension mit 19,5 mL Medium ergibt 20 mL mit einer Konzentration von 50.000 Zellen/mL, also eine Verdünnung von 1 zu 40.

Fehlerquellen

Die Formel selbst ist exakt. Fehler entstehen durch die eingesetzten Zahlen.

• Zählfehler. Eine falsche Zellzahl führt unmittelbar zu einer falschen Verdünnung. Dieses Risiko lässt sich verringern, indem alle vier Eckquadrate eines Zählkammergitters gezählt und die Werte gemittelt werden.
• Zellaggregate. Ein Zellaggregat sieht unter dem Mikroskop wie eine einzelne Zelle aus, besteht aber tatsächlich aus mehreren Zellen und verringert dadurch die scheinbare Konzentration.
• Pipettenbereich. Eine Pipette, die außerhalb ihres angegebenen Volumenbereichs verwendet wird, liefert ungenaue Ergebnisse. Eine auf 1000 μL eingestellte Pipette, die 5 μL ausgeben soll, ist nicht zuverlässig; stattdessen sollte eine kleinere Pipette verwendet werden.
• Verwechslung von Einheiten. Werden Zellen/mL und Zellen/μL miteinander vermischt, ist der Fehler tausendmal zu groß oder zu klein.
• Abgestorbene Zellen. Eine nicht weiter differenzierte Zellzählung umfasst auch abgestorbene Zellen, sofern kein Vitalitätsfarbstoff wie Trypanblau verwendet wurde. Dadurch kann die tatsächlich vorhandene Zahl lebender Zellen überschätzt werden.

Grenzen dieses Rechners

Der Rechner weist Zahlen zurück, mit denen kein sinnvolles Ergebnis berechnet werden kann:

• Jeder Wert muss größer als null sein.
• Die Zielkonzentration darf nicht höher sein als die Ausgangskonzentration.
• Die Ausgangskonzentration darf höchstens 1 Billion Zellen/mL (1 × 10¹²) betragen.
• Das berechnete Volumen der Stammsuspension muss mindestens 0,001 mL, also 1 Mikroliter, betragen. Kleinere Volumina können nicht genau pipettiert werden; deshalb fordert der Rechner stattdessen andere Werte an. Eine Erhöhung des Gesamtvolumens behebt dieses Problem meist.

Volumina werden mit zwei Dezimalstellen angezeigt, bei einem Stammvolumen unter 0,01 mL mit drei, damit ein kleines Volumen nie als 0,00 mL erscheint.

Häufig gestellte Fragen

Wie lautet die Formel für die Zellverdünnung?

C₁ × V₁ = C₂ × V₂; dabei sind C₁ und C₂ die Ausgangs- und Zielkonzentration und V₁ und V₂ das aus der Stammsuspension entnommene Volumen beziehungsweise das gesamte Endvolumen.

Kann die Zielkonzentration höher sein als die Ausgangskonzentration?

Nein. Durch Verdünnen sinkt die Konzentration nur. Um eine höhere Konzentration zu erreichen, müssen die Zellen zentrifugiert und in einem kleineren Volumen resuspendiert werden.

Welche Flüssigkeit sollte zum Verdünnen von Zellen verwendet werden?

Vollständiges Kulturmedium wird verwendet, wenn die Zellen über Stunden oder Tage gesund bleiben müssen, etwa vor dem Ausplattieren. PBS oder eine ähnliche gepufferte Kochsalzlösung eignet sich für kurze Verdünnungen von weniger als etwa 30 Minuten, bevor die Zellen weiterverarbeitet werden. Serumfreies Medium wird verwendet, wenn Serumproteine einen nachfolgenden Assay stören würden.

Funktioniert diese Formel auch für Bakterien oder Hefen?

Ja. C₁V₁ = C₂V₂ gilt für jede Suspension von Partikeln, einschließlich Bakterien, die in koloniebildenden Einheiten pro Milliliter (KBE/mL) gemessen werden, Hefen und viralen Partikeln, die in Plaque-bildenden Einheiten pro Milliliter (PFU/mL) gemessen werden, sofern auf beiden Seiten der Gleichung dieselben Einheiten verwendet werden.

Sollten abgestorbene Zellen bei der Verdünnung mitgezählt werden?

Für das Ausplattieren einer lebenden Kultur sollten nur lebensfähige Zellen gezählt werden. Wenn eine Suspension zu 80 % lebensfähig ist, beträgt ihre Konzentration lebensfähiger Zellen 0,8 der Gesamtzellzahl; diese Konzentration sollte als C₁ verwendet werden.

Wie lassen sich sehr große Verdünnungen genau herstellen?

Große Verdünnungen, etwa 1 zu 1000, werden meist als eine Folge kleinerer Schritte, sogenannte serielle Verdünnungen, durchgeführt. Drei aufeinanderfolgende Verdünnungen von 1 zu 10 ergeben insgesamt eine Verdünnung von 1 zu 1000, wobei jeder Pipettierschritt innerhalb eines genauen Volumenbereichs bleibt.