Protein-Konzentrationsrechner | A280 zu mg/mL

Rechner für die Proteinkonzentration

Ein Rechner für die Proteinkonzentration wandelt einen Lichtabsorptionsmesswert eines Spektrophotometers in die Menge des in einer Lösung gelösten Proteins um. Das Ergebnis wird gewöhnlich in Milligramm pro Milliliter (mg/mL) oder Mikrogramm pro Milliliter (μg/mL) angegeben. Die Berechnung basiert auf dem Beer-Lambert-Gesetz, einer Beziehung in der Chemie, die damit verknüpft, wie viel Licht eine Probe absorbiert und wie viel eines Stoffes sie enthält.

Messung der Proteinkonzentration

Die meisten Proteine absorbieren ultraviolettes Licht bei einer Wellenlänge von 280 Nanometern (nm) stark. Diese Absorption stammt hauptsächlich von den beiden Aminosäuren Tryptophan und Tyrosin, die in der Struktur des Proteins vorkommen. Ein Spektrophotometer leitet Licht durch die Probe und misst, wie viel davon die Probe absorbiert. Dieser Messwert wird als Absorbanz bezeichnet oder als A280, wenn er bei 280 nm aufgenommen wurde.

Die Messung der Absorbanz bei 280 nm ist schnell und zerstört die Probe nicht. Dadurch unterscheidet sie sich von chemischen Verfahren wie dem Bradford- oder BCA-Assay, die weiter unten beschrieben werden. Die Methode funktioniert am besten mit einem gereinigten Protein in Lösung und einem Absorbanzmesswert zwischen etwa 0,1 und 1,0. Messwerte außerhalb dieses Bereichs sind weniger zuverlässig, daher muss eine Probe vor der Messung häufig verdünnt werden.

Formel für die Proteinkonzentration

Der Rechner stellt das Beer-Lambert-Gesetz um, um die Konzentration zu bestimmen:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — Proteinkonzentration in mg/mL
• A — Absorbanz bei 280 nm (eine reine Zahl ohne Einheit)
• DF — Verdünnungsfaktor, also die Anzahl, wie oft die ursprüngliche Probe vor der Messung verdünnt wurde
• ε — Extinktionskoeffizient, eine für das Protein spezifische Konstante in L/(g·cm)
• l — Schichtlänge, die Strecke, die das Licht durch die Probe zurücklegt, in cm (gewöhnlich 1 cm in einer Standardküvette, einem kleinen Glas- oder Kunststoffgefäß für das Spektrophotometer)

Um das Ergebnis in Mikrogramm pro Milliliter umzurechnen, wird der Wert in mg/mL mit 1.000 multipliziert. Um die Gesamtmasse des Proteins in der Probe zu bestimmen, wird die Konzentration mit dem Probenvolumen in Millilitern multipliziert.

Durchgerechnetes Beispiel

Eine Probe weist bei 280 nm eine Absorbanz von 0,5 auf. Sie wurde nicht verdünnt, daher beträgt der Verdünnungsfaktor 1, und sie wurde in einer Standardküvette mit 1 cm gemessen. Das Protein ist Rinderserumalbumin (BSA) mit einem Extinktionskoeffizienten von 0,667 L/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/mL

In einer 1 mL-Probe entspricht das etwa 0,75 mg Gesamtprotein oder 750 μg/mL.

Extinktionskoeffizienten gängiger Proteine

Jedes Protein absorbiert Licht anders, da es jeweils eine unterschiedliche Anzahl an Tryptophan- und Tyrosinresten besitzt. Der Extinktionskoeffizient beschreibt dies für ein bestimmtes Protein bei 280 nm in der Einheit L/(g·cm). Häufig verwendete Werte sind:

Ein Rechner kann auch einen benutzerdefinierten Extinktionskoeffizienten für ein Protein akzeptieren, das nicht in dieser Liste enthalten ist. Für ein Protein mit bekannter Aminosäuresequenz kann dieser Wert mit einer von Gill und von Hippel in 1989 veröffentlichten Formel geschätzt werden: ε₂₈₀ = (Tryptophanreste × 5.500) + (Tyrosinreste × 1.490) + (Cystinreste × 125). Diese Formel liefert ein Ergebnis in M⁻¹cm⁻¹, einer molaren Einheit, die sich von den oben genannten massenbezogenen Werten in L/(g·cm) unterscheidet. Kostenlose Werkzeuge wie ProtParam, das auf dem ExPASy-Server bereitgestellt wird, berechnen diesen Wert direkt aus einer Proteinsequenz.

Schichtlänge und Verdünnungsfaktor

Die Schichtlänge ist die Breite der Küvette, die die Probe enthält, gemessen in Zentimetern. Standardküvetten sind 1 cm breit. Mikrovolumen-Spektrophotometer, die sehr kleine Proben messen, können eine deutlich kürzere Schichtlänge verwenden, beispielsweise 0,1 cm.

Der Verdünnungsfaktor berücksichtigt jede vor der Messung vorgenommene Verdünnung. Wenn eine konzentrierte Probe eine Absorbanz von über 1,0 ergeben würde, wird sie üblicherweise zunächst mit Puffer verdünnt. Der Verdünnungsfaktor entspricht dem Gesamtvolumen der verdünnten Probe geteilt durch das ursprüngliche Probenvolumen. Werden beispielsweise 10 μL Probe mit 990 μL Puffer gemischt, ergibt sich ein Gesamtvolumen von 1.000 μL und ein Verdünnungsfaktor von 100.

Andere Methoden zur Messung der Proteinkonzentration

Die Absorbanz bei 280 nm ist eine von mehreren gängigen Methoden im Labor.

• Bradford-Assay: Verwendet einen Farbstoff, der bei der Bindung an Protein seine Farbe ändert. Er eignet sich gut für ungereinigte Proben, doch die Farbänderung kann zwischen verschiedenen Proteinen variieren.
• BCA-Assay: Beruht auf einer durch die Peptidbindungen des Proteins verursachten Farbänderung. Er ist mit vielen Detergenzien kompatibel, benötigt jedoch mehr Zeit als eine direkte Absorbanzmessung.
• Lowry-Methode: Ein älteres Verfahren, das sehr empfindlich ist, aber mit einigen gängigen Pufferbestandteilen schlecht reagiert.

Jede dieser drei Methoden zerstört die Probe. Eine direkte A280-Messung tut dies nicht, sodass dieselbe Probe zurückgewonnen und erneut verwendet werden kann.

Häufig gestellte Fragen

Welcher Absorbanzbereich ist für diese Methode ideal?

Zwischen 0,1 und 1,0. Unter 0,1 ist der Messwert ungenau. Über 1,0 ist die Beziehung zwischen Absorbanz und Konzentration möglicherweise nicht mehr linear, daher sollte die Probe zunächst verdünnt werden.

Warum bei 280 nm und nicht bei 260 nm messen?

Nukleinsäuren wie DNA und RNA absorbieren bei 260 nm stark. Proteine absorbieren aufgrund ihres Tryptophan- und Tyrosingehalts stärker bei 280 nm. Die Messung bei 280 nm verringert die Störung durch möglicherweise in der Probe vorhandene Nukleinsäuren.

Wie wird der Extinktionskoeffizient für ein nicht aufgeführtes Protein bestimmt?

Für ein Protein mit bekannter Sequenz berechnet ein Werkzeug wie ProtParam den Wert anhand der Anzahl der Tryptophan-, Tyrosin- und Cystinreste. Er kann auch direkt gemessen werden, indem die Absorbanz der Probe mit der einer Lösung bekannter Konzentration verglichen wird.

Funktioniert diese Methode für ein Gemisch aus Proteinen?

Sie funktioniert am besten für ein einzelnes, gereinigtes Protein mit bekanntem Extinktionskoeffizienten. Ein Gemisch unbekannter Proteine, beispielsweise ein Zelllysat, wird gewöhnlich stattdessen mit dem Bradford- oder BCA-Assay gemessen, da diese Methoden eine gleichmäßigere Schätzung des Gesamtproteins liefern.

Können Detergenzien den Messwert beeinflussen?

Ja. Viele Detergenzien absorbieren Licht in der Nähe von 280 nm, was das Ergebnis verfälschen kann. Die Verwendung einer Blindprobe mit derselben Detergenzienkonzentration hilft, diese Hintergrundabsorbanz herauszurechnen. Sehr hohe Detergenzienkonzentrationen können stattdessen einen detergenzienkompatiblen Assay wie den BCA-Assay erforderlich machen.