qPCR Effizienz-Rechner: Standardkurven-Analysewerkzeug

qPCR-Effizienzrechner

Ein qPCR-Effizienzrechner schätzt, wie gut eine quantitative PCR (qPCR) die Ziel-DNA-Sequenz in jedem Amplifikationszyklus kopiert. Er verwendet Ct-Werte (die Zykluszahl, bei der das Fluoreszenzsignal einen festgelegten Schwellenwert überschreitet) aus einer Verdünnungsreihe, um Effizienz, Steigung, Achsenabschnitt und R² zu berechnen.

Was ist qPCR-Effizienz?

Die quantitative PCR verfolgt die Fluoreszenz, während eine Reaktion die Ziel-DNA-Sequenz Zyklus für Zyklus kopiert. Die Amplifikationseffizienz beschreibt, um wie viel die Menge der Ziel-DNA in jedem Zyklus zunimmt. Bei einer Effizienz von 100 % verdoppelt sich die Menge der Ziel-DNA in jedem Zyklus.

Reale Reaktionen erreichen nur selten genau 100 %. Die meisten Labore betrachten eine Effizienz zwischen 90 % und 110 % als akzeptabel für eine zuverlässige Quantifizierung. Ein Wert unter 90 % oder über 110 % weist auf ein Problem hin, etwa ein schlechtes Primerdesign, aus der Probenextraktion übertragene PCR-Inhibitoren oder Pipettierfehler in der Verdünnungsreihe.

Die Effizienz ist besonders beim Vergleich der Genexpression zwischen Proben wichtig. Die übliche ΔΔCt-Methode zur Berechnung der Fold-Changes setzt voraus, dass jede Reaktion mit einer Effizienz von 100 % abläuft. Wenn die gemessene Effizienz von 100 % abweicht oder ein Zielgen und ein Referenzgen unterschiedliche Effizienzen haben, sind die Fold-Change-Ergebnisse möglicherweise ungenau.

Formel für die qPCR-Effizienz

Die Effizienz wird aus der Steigung der Standardkurve berechnet, einer Geraden, die durch Auftragen der Ct-Werte gegen den Logarithmus zur Basis 10 (log10) der Ausgangsmenge an DNA in einer Verdünnungsreihe entsteht.

E = 10^(-1/Steigung) - 1

E ist die Effizienz, als Dezimalzahl ausgedrückt (für die Prozentangabe mit 100 multiplizieren). Die Steigung ist die Steigung der Geraden der Standardkurve. Sie ist negativ, weil der Ct-Wert steigt, wenn die Ausgangsmenge an DNA sinkt.

Eine Steigung von -3,32 entspricht einer Effizienz von 100 %:

10^(-1/-3,32) - 1 = 10^0,301–1 ≈ 1,00

Das ergibt sich daraus, dass eine 10-fache Verdünnung den Ct-Wert um etwa 3,32 Zyklen verschieben sollte, wenn die Reaktion ihre DNA in jedem Zyklus verdoppelt, da log2(10) ungefähr 3,32 entspricht.

In der Praxis gilt eine Steigung zwischen -3,1 und -3,6 als akzeptabel. Dieser Bereich entspricht einer Effizienz von ungefähr 90 % bis 110 %. Eine Steigung näher bei -3,1 ergibt eine höhere berechnete Effizienz; eine Steigung näher bei -3,6 eine niedrigere.

So wird die qPCR-Effizienz berechnet: die Standardkurvenmethode

1. Eine Verdünnungsreihe herstellen. Mit der am stärksten konzentrierten Probe beginnen und sie für jede folgende Probe um einen festen Faktor, üblicherweise um das 10-Fache, verdünnen. Mit jeder Verdünnung eine qPCR durchführen und den Ct-Wert erfassen.
2. Jede Verdünnung in einen log10-Wert umwandeln. Wird die erste, am stärksten konzentrierte Probe als Position 0 gezählt, ist der log10-Wert der relativen Menge für die Probennummer i gleich -i × log10(Verdünnungsfaktor).
3. Für jede Verdünnung Ct (vertikale Achse) gegen den log10-Wert (horizontale Achse) auftragen und eine lineare Regression durchführen.
4. Steigung, Achsenabschnitt und R² der Regressionsgeraden ablesen.
5. Die Steigung in E = 10^(-1/Steigung) - 1 einsetzen, um die Effizienz zu erhalten.

Qualitätskriterien für die Standardkurve

• R² von mindestens 0,98. Dieser Wert misst, wie eng die Punkte auf einer Geraden liegen. Ein niedrigerer Wert weist häufig auf Pipettierfehler oder eine uneinheitliche Amplifikation hin.
• Steigung zwischen -3,1 und -3,6. Dieser Bereich entspricht einer Effizienz von 90–110%.
• Mindestens drei Verdünnungspunkte. Fünf oder sechs Punkte ergeben eine zuverlässigere Gerade und erleichtern das Erkennen eines Ausreißers.
• Die am stärksten konzentrierte Probe sollte einen Ct-Wert von etwa 15-20 ergeben. Die am stärksten verdünnte Probe sollte unter Ct 35 bleiben, da höhere Werte nahe an die Nachweisgrenze herankommen.

Beispielrechnung

Eine fünfstufige Verdünnungsreihe mit einer Verdünnung um das 10-Fache ergibt folgende Ct-Werte, von der höchsten bis zur niedrigsten Konzentration: 15,0, 18,5, 22,0, 25,5, 29,0.

Die Werte für log10(relative Menge) sind 0, -1, -2, -3, -4, da jeder Verdünnungsschritt -log10(10), also -1, hinzufügt. Der Ct-Wert steigt bei jedem Schritt um 3,5 Zyklen, sodass die Punkte auf einer Geraden liegen und die lineare Regression Folgendes ergibt:

• Steigung: -3,5
• Achsenabschnitt: 15,0
• R²: 1,0

Effizienz: E = 10^(-1/-3,5) - 1 = 10^0,286–1 ≈ 0,931, also etwa 93 %.

Eine Effizienz von 93 % mit R² = 1,0 erfüllt die üblichen Qualitätskriterien und ist für die Quantifizierung der Genexpression geeignet.

Codebeispiel

Diese JavaScript-Funktion folgt derselben Methode wie der Rechner. Der Index jedes Ct-Werts wird vor der Logarithmierung negiert, da die erste, am stärksten konzentrierte Probe die höchste relative Menge aufweist und jede folgende Probe stärker verdünnt ist.

1function qpcrEfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
2  // Sample 0 is most concentrated; each later sample is diluted further,
3  // so its log10(relative quantity) is negative.
4  const x = ctValues.map((_, i) => -i * Math.log10(dilutionFactor));
5  const n = ctValues.length;
6  let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0;
7  for (let i = 0; i < n; i++) {
8    sumX += x[i];
9    sumY += ctValues[i];
10    sumXY += x[i] * ctValues[i];
11    sumXX += x[i] * x[i];
12  }
13  const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
14  const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
15  const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
16  return { efficiency, slope, intercept };
17}
18
19qpcrEfficiency([15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0], 10);
20// => { efficiency: 93.07, slope: -3.5, intercept: 15 }
21

Warum die Effizienz für die Genexpression wichtig ist

Berechnungen von Fold-Change-Werten, einschließlich der ΔΔCt-Methode, setzen voraus, dass jede Reaktion ihr Ziel in jedem Zyklus verdoppelt. Wenn ein Zielgen und ein Referenzgen unterschiedliche gemessene Effizienzen haben, führt die einfache ΔΔCt-Formel zu Fehlern. Bei Effizienzunterschieden von mehr als etwa fünf Prozentpunkten wechseln Forschende häufig zu einer effizienzkorrigierten Berechnung, etwa der von Michael Pfaffl in 2001 beschriebenen Methode. Die MIQE-Leitlinien, ein häufig zitierter Satz von Berichtsstandards für qPCR, der in 2009 veröffentlicht wurde, empfehlen, die berechnete Effizienz, die Steigung und R² zusammen mit den Quantifizierungsergebnissen anzugeben.

Häufig gestellte Fragen

Welcher qPCR-Effizienzprozentsatz ist gut?

Ein Bereich zwischen 90 % und 110 % wird allgemein akzeptiert; bei gut optimierten Assays liegt die Effizienz bei etwa 95–105%. Eine Steigung von -3,32 entspricht genau 100 %.

Warum liegt meine qPCR-Effizienz über 110 %?

Häufige Ursachen sind Pipettierfehler in der Verdünnungsreihe, Primerdimere, Inhibitoren, die konzentrierte und verdünnte Proben unterschiedlich stark beeinflussen, oder ein Fluoreszenzschwellenwert außerhalb der exponentiellen Amplifikationsphase. Eine Schmelzkurve mit mehr als einem Peak kann auf Primerdimere hinweisen.

Warum liegt meine qPCR-Effizienz unter 90 %?

Mögliche Ursachen sind ein schlechtes Primerdesign, aus der Probenextraktion übertragene PCR-Inhibitoren oder eine nicht optimale Annealing-Temperatur. Die Überprüfung der Primerspezifität und die Durchführung eines Temperaturgradienten können helfen, die Ursache zu finden.

Was bedeutet ein niedriger R²-Wert?

R² misst, wie gut die Ct-Werte in Abhängigkeit von der logarithmierten Menge auf einer Geraden liegen. Ein Wert unter 0,98 deutet auf uneinheitliches Pipettieren, eine inhibierte Probe oder einen Verdünnungspunkt nahe der Nachweisgrenze hin.

Wie viele Verdünnungspunkte benötigt eine Standardkurve?

Mindestens drei, da dies die für eine lineare Regression erforderliche Mindestzahl ist. Fünf oder sechs Punkte ergeben eine zuverlässigere Steigung und erleichtern das Erkennen von Ausreißern.

Kann sich die Effizienz zwischen Experimenten ändern?

Ja. Eine neue Reagenziencharge, eine neue Primercharge, ein anderer Probentyp oder ein anderes qPCR-Gerät kann die Effizienz verändern. Viele Labore überprüfen die Effizienz alle paar Monate oder mit jeder neuen Reagenziencharge erneut.

Referenzen

1. Bustin SA, Benes V, Garson JA et al. Die MIQE-Leitlinien: Mindestinformationen für die Veröffentlichung quantitativer Echtzeit-PCR-Experimente. Clinical Chemistry. 2009;55(4):611-622.
2. Pfaffl MW. Ein neues mathematisches Modell zur relativen Quantifizierung bei der Echtzeit-RT-PCR. Nucleic Acids Research. 2001;29(9):e45.
3. Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Wie gut ist eine Schätzung der PCR-Effizienz: Empfehlungen für präzise und zuverlässige Bewertungen der qPCR-Effizienz. Biomolecular Detection and Quantification. 2015;3:9-16.