Kalibrierkurven-Rechner | Lineare Regression für Laboranalysen

Was ist ein Kalibrierkurvenrechner?

Ein Kalibrierkurvenrechner wandelt Messwerte eines Instruments in Konzentrationen um. Dazu wird eine Gerade durch Datenpunkte von Standards mit bekannter Konzentration gelegt und anschließend verwendet, um einen neuen Messwert in eine Konzentration umzurechnen. Laboratorien verwenden Kalibrierkurven in der Chemie, Biologie und Umweltanalytik, wenn ein Instrument ein Signal wie die Absorbanz oder die Peakfläche statt direkt einer Konzentration ausgibt.

Der Rechner auf dieser Seite legt mithilfe der linearen Regression, der Methode der kleinsten Quadrate, eine Gerade durch die Punkte. Er gibt die Steigung, den Achsenabschnitt und R² aus, ein Maß dafür, wie genau die Punkte der Geraden folgen. Anschließend kann er aus einem gemessenen Signal die Konzentration einer unbekannten Probe schätzen.

Die Formel der Kalibrierkurve

Eine Kalibrierkurve setzt einen linearen Zusammenhang zwischen Konzentration und Signal voraus:

$y = mx + b$

• $y$ ist das Signal (das, was das Instrument misst)
• $x$ ist die Konzentration
• $m$ ist die Steigung
• $b$ ist der y-Achsenabschnitt

So werden Steigung und Achsenabschnitt berechnet

Für eine Menge von $n$ Punkten lauten die Steigung und der Achsenabschnitt, die am besten zu den Daten passen (im Sinne der kleinsten Quadrate):

$m = \frac{\sum_{i=1}^{n}(x_i - \bar{x})(y_i - \bar{y})}{\sum_{i=1}^{n}(x_i - \bar{x})^2}$

$b = \bar{y} - m\bar{x}$

Dabei sind $\bar{x}$ und $\bar{y}$ die mittlere Konzentration und das mittlere Signal aller Punkte.

Formel für R²

R², der Determinationskoeffizient, zeigt, wie gut die Gerade zu den Daten passt:

$R^2 = 1 - \frac{\sum_{i=1}^{n}(y_i - \hat{y}_i)^2}{\sum_{i=1}^{n}(y_i - \bar{y})^2}$

$\hat{y}_i$ ist das Signal, das die Gerade für jedes $x_i$ vorhersagt. R² reicht von 0 bis 1. Ein Wert von 1 bedeutet, dass jeder Punkt genau auf der Geraden liegt.

Formel für die unbekannte Konzentration

Sobald Steigung und Achsenabschnitt bekannt sind, lässt sich ein gemessenes Signal $y$ wieder in eine Konzentration umrechnen:

$x = \frac{y - b}{m}$

Ergibt diese Berechnung eine negative Zahl, gibt der Rechner die Konzentration als 0 aus, da eine negative Konzentration physikalisch nicht sinnvoll ist.

Rechenbeispiel

Angenommen, vier Standards liefern die folgenden Ergebnisse:

Die mittlere Konzentration beträgt 3 und das mittlere Signal 0,20.

Steigung:

$m = \frac{(-3)(-0.15) + (-1)(-0.05) + (1)(0.04) + (3)(0.16)}{(-3)^2 + (-1)^2 + 1^2 + 3^2} = \frac{1.02}{20} = 0.0510$

Achsenabschnitt:

$b = 0.20 - (0.0510)(3) = 0.0470$

R²: Der Vergleich der vorhergesagten mit den tatsächlichen Signalen ergibt R² = 0,9966.

Die angepasste Gerade lautet:

$y = 0.0510x + 0.0470 \quad (R^2 = 0.9966)$

Angenommen, eine unbekannte Probe liefert nun ein Signal von 0,20. Ihre Konzentration beträgt:

$x = \frac{0.20 - 0.0470}{0.0510} = 3.0000$

Verwendung dieses Rechners

1. Geben Sie die bekannte Konzentration jedes Standards und sein gemessenes Signal als Zahlenpaar ein. Der Rechner beginnt mit zwei Zeilen.
2. Wählen Sie „Datenpunkt hinzufügen“, um weitere Standards einzugeben, oder „Datenpunkt entfernen“ neben einer Zeile, um diese zu löschen. Es sind mindestens zwei Punkte erforderlich.
3. Sobald mindestens zwei Punkte eingetragen sind, zeigt der Rechner die Regressionsgleichung, den Wert R² und ein Diagramm der Punkte mit der angepassten Geraden.
4. Geben Sie unter „Unbekannte Konzentration berechnen“ ein gemessenes Signal ein, um die entsprechende Konzentration anzuzeigen. Die Anzeige wird automatisch aktualisiert, während der Wert eingegeben wird; es gibt keine separate Schaltfläche, die betätigt werden muss.
5. Wählen Sie „Zurücksetzen“, um alle eingegebenen Punkte und das Feld für das Signal zu löschen und neu zu beginnen.

Interpretation von Steigung, Achsenabschnitt und R²

Die Steigung zeigt, um wie viel sich das Messsignal pro Konzentrationseinheit ändert. Eine größere Steigung bedeutet, dass die Methode empfindlich auf kleine Konzentrationsänderungen reagiert.

Der Achsenabschnitt ist das bei einer Konzentration von null vorhergesagte Messsignal. Er spiegelt das Hintergrundsignal wider, etwa das Signal einer Leerprobe oder die Basislinie des Instruments. Ein von null verschiedener Achsenabschnitt ist häufig und nicht automatisch problematisch. Ein großer oder zwischen Kalibrierungen uneinheitlicher Achsenabschnitt kann jedoch auf eine Kontamination oder einen Instrumentenfehler hindeuten.

R² zeigt, wie genau die Punkte einer Geraden folgen. Werte über 0,99 sind typisch für eine gut funktionierende lineare Methode. Ein niedrigerer R²-Wert kann auf einen Pipettierfehler, einen beschädigten Standard oder einen Konzentrationsbereich hinweisen, in dem die Antwort nicht mehr linear ist.

Anwendungsbereiche von Kalibrierkurven

Kalibrierkurven werden häufig verwendet, wenn das Rohsignal eines Instruments in eine Konzentration umgerechnet werden muss:

• Spektrophotometrie — Die Absorbanz von Licht wird gemessen und in eine Konzentration umgerechnet, beispielsweise bei der Bestimmung des Protein- oder Pigmentgehalts.
• Chromatografie (HPLC, GC) — Peakfläche oder Peakhöhe eines Chromatogramms wird in eine Konzentration umgerechnet, häufig bei der Arzneimittelprüfung und der Umweltanalytik.
• ELISA und andere Immunoassays — Die Farb- oder Fluoreszenzintensität eines Plattenlesegeräts wird in eine Antigen- oder Antikörperkonzentration umgerechnet.
• qPCR — Ct-Werte aus seriellen Verdünnungen einer Probe mit bekannter Konzentration bilden eine Kurve, mit der sich die Menge genetischen Materials in einer unbekannten Probe schätzen lässt.

Wenn eine Gerade nicht passt

Einige Methoden sind über ihren gesamten Messbereich hinweg nicht linear. Häufige Lösungen sind die Beschränkung der Kalibrierung auf einen engeren, linearen Bereich, eine logarithmische Transformation vor der Anpassung einer Geraden, die Verwendung einer polynomialen (gekrümmten) Anpassung oder eine gewichtete Regression, wenn der Messfehler mit der Konzentration zunimmt oder abnimmt. Dieser Rechner passt nur eine Gerade an. Wenn die Punkte eindeutig eine Krümmung bilden, sind die Ergebnisse weniger zuverlässig und möglicherweise wird ein anderes Modell benötigt.

Häufig gestellte Fragen

Was ist eine Kalibrierkurve?

Eine Kalibrierkurve ist eine an die Messwerte des Instruments für Proben mit bekannter Konzentration angepasste Gerade. Sie wird verwendet, um einen neuen Messwert einer Probe mit unbekannter Konzentration in einen Konzentrationswert umzurechnen.

Wie viele Datenpunkte benötigt eine Kalibrierkurve?

Der Rechner benötigt mindestens zwei Punkte, um eine Gerade anzupassen. Zwei Punkte können jedoch nicht zeigen, ob der tatsächliche Zusammenhang wirklich linear ist. Die meisten Laboratorien verwenden fünf bis acht Standards, die den erwarteten Bereich der unbekannten Proben abdecken.

Was bedeutet R² bei einer Kalibrierkurve?

R² misst, wie genau die Datenpunkte der angepassten Geraden folgen, auf einer Skala von 0 bis 1. Ein Wert von 1 bedeutet, dass jeder Punkt genau auf der Geraden liegt. Werte über 0,99 gelten allgemein als deutlicher Beleg für einen linearen Zusammenhang.

Können Konzentrationen außerhalb des Bereichs der Standards geschätzt werden?

Die Schätzung einer Konzentration unterhalb des niedrigsten oder oberhalb des höchsten Standards ist unzuverlässig, da keine Daten bestätigen, dass die Gerade dort weiterhin linear verläuft. Besser ist es, eine Probe mit einem zu hohen Messwert zu verdünnen oder eine Probe mit einem zu niedrigen Messwert aufzukonzentrieren und innerhalb des kalibrierten Bereichs erneut zu messen.

Warum wird die berechnete Konzentration manchmal als 0 angezeigt?

Liegt ein gemessenes Signal unter dem angepassten Achsenabschnitt (bei positiver Steigung), ergibt die Formel $x = (y - b) / m$ eine negative Zahl. Der Rechner zeigt in diesem Fall 0 an, da eine reale Konzentration nicht negativ sein kann.

Was ist der Unterschied zwischen Steigung und Achsenabschnitt?

Die Steigung beschreibt, wie empfindlich das Signal auf eine Änderung der Konzentration reagiert. Der Achsenabschnitt ist das bei einer Konzentration von null vorhergesagte Signal und spiegelt häufig das Hintergrundsignal statt des Analyten selbst wider.

Referenzen

1. National Institute of Standards and Technology. NIST/SEMATECH e-Handbook of Statistical Methods, 4.1.4.1: Linear Least Squares Regression. NIST: Lineare Regression nach der Methode der kleinsten Quadrate — Die Parameter werden durch Minimierung der Summe der quadrierten Abweichungen zwischen den Daten und der Geraden geschätzt.
2. National Institute of Standards and Technology. NIST/SEMATECH e-Handbook of Statistical Methods, 4.5.2.1: Single-Use Calibration Intervals. NIST: Einmalige Kalibrierung — Ein neues Signal wird der angepassten Geraden gleichgesetzt und nach der Unbekannten aufgelöst, x = (y − b) ÷ m bei einer Geraden.